У Республіці Білорусь склалася наступна структура управління роботою з трансплантації ембріонів (рис. 5.7).
Мал. 5.7.Структура управління і форми організації роботи по
А. Головним замовником. фінансує роботу по трансплантації ембріонів, є племотдел Мінсільгосппроду.
Підприємством, що доводить завдання до виконавця, виступає Белплемжівоб'едіненіе.
Б.Головнимі підприємствами координують роботу є Жодінского, Гродненський і Брестський центри з трансплантації ембріонів.
В їх обов'язки входить:
- здійснення практичної допомоги в організації роботи по трансплантації в республіці;
- створення кріобанку ембріонів;
-навчання і перенавчання фахівців з трансплантації на місцях;
-здійснення всієї науково-методичної роботи в республіці з питань трансплантації ембріонів.
В.Ісполнітелямі роботи є ОБЛПЛЕМПІДПРИЄМСТВО і племінні господарства, де зосереджено поголів'я високоцінних корів - донорів і є пункти, обладнані для роботи з ембріонами. Їх основна функція:
а) отримання бугаїв-плідників для Госплемпредпріятій і генетично цінного молодняку для ремонту поголів'я дійного стада зазначених племзаводів.
б) створення кріобанку ембріонів від видатних корів-донорів.
5.5. Методи трансплантації ембріонів.
Хірургічний метод трансплантації ембріонів свиней.
Трансплантація ембріонів в свинарстві відкриває перспективи для прискореного і більш широкого використання видатних племінних свиноматок в селекційному процесі.
Метод є базовим при отриманні трансгенних тварин в лабораторіях генно-інженерного профілю США, Канади, Англії, ПАР та ін.
Мета проведеної роботи - вихід на вирішення наступних завдань біотехнології.
1. Інтенсивне розведення типів і ліній тварин з потрібним генотипом за особливостями росту і розвитку.
2. Створення тварин стійких до тих чи інших захворювань і передавальних ця ознака потомству.
3. Збільшення ефекту генетичного прогресу за селекційному ознакою з 1-2 до 7-10% на рік.
4. Відкриття доступу до ооцитів, зигота і ембріонам для потреб генно-інженерних досліджень.
5. Обмін між країнами і континентами зародками від видатних за продуктивністю, але частіше, екзотичних карликових порід для утримання в житлово-побутових умовах.
Метод хірургічного вилучення та пересадки зародків у свиней пов'язаний з особливостями будови у них статевих органів. Він являє чітко організований технологічний процес, що складається з 10 етапів (рис. 5.8).
1. Відбір донорів і реципієнтів протягом першої доби після відлучення поросят.
2. Стимуляція полювання ГСЖК через 24 години і синхронізація поліовуляції у них через 72 години хорионическим гонадотропином (хоріогонін) після відлучення поросят.
3. Запліднення через 24 і 48 годин після ін'єкції хоріогоніна.
4. Проведення загальних операційного наркозу.
5. Отримання зародків методом порожнинної лапаротомії на 3-й день після запліднення.
6. Культивування їх в середовищі Дюльбекко, що містить 20% фетальної сироватки (не більше 3 діб).
7. Мікроскопічна оцінка на придатність до пересадки.
Мал. 5.8. Етапи застосування хірургічного методу
трансплантації ембріонів свиней
8. Транспортування до місця розташування реципієнтів.
9. Проведення загальних операційного наркозу і пересадка ембріонів свиноматкам-реципієнтам.
10. Отримання опоросів.
Як донорського матеріалу імпортують і використовують зародки екзотичних декоративних карликових порід свинок, розрахованих для подальшого утримання в житлово-побутових умовах, як домашніх улюбленців. Зародки транспортують в пробірках з живильним середовищем, де вони зберігають життєздатність близько 3 діб.
Синхронізацію полювання і поліовуляція викликають за допомогою ін'єкцій сироваткового гонадотропіну (ГСЖК) в поєднанні з хоріонічним гонадотропіном (ХГ). Оптимальною дозою ГСЖК є 11 ИЕ / кг живої маси. Ін'єкцію хоріогоніна проводять в дозі 5 ИЕ / Кг живої маси через 72 години після відлучення поросят. Результату обробки представлені в табл. 5.6.
Таблиця 5.6. Результати стимуляції поліовуляції фолікулів у свиноматок
Реакція яєчників (число овуляцій)
Премедикацію (потенціювання загального операційного наркозу) проводять за допомогою попереднього внутрішньом'язового введення транквілізатора аміназину. Основним наркотичною речовиною при цьому є розчин хлоралгідрату (0,04 г / кг ж. М.) Ректально. Препарат попередньо розчиняють в крохмальної клейстер до консистенції густого киселю. Премедикація перед наркозом необхідна для зниження дози введення хлоралгідрату до оптимального рівня. Аміназин вводять в дозі 0,21 мл / кг живої маси дворазово, з інтервалом 40 хв.
Після введення аміназину ефект змикання століття у тварин настає через 45 хвилин. Ефект глибокого наркозного сну після ректального введення хлоралгідрату проявляється вже через 10 хвилин. Тривалість його становить 55 хвилин. Цього цілком достатньо для здійснення операції по вилученню або пересадці зародків, яка триває в середньому від 25 до 35 хвилин. Вихід свиноматок з наркозу проходить без випадків ускладнень. Тварини самостійно пересуваються з операційної в індивідуальні бокси.
Тривалість наркозного сну у свиноматок при проведенні трансплантації представлена в табл. 5.7.
При хірургічному витяганні ембріонів лапаротомию (розтин черевної стінки) здійснюють по білій лінії живота між другою задньої парою молочних сосків. Довжина розрізу 8-10 см. Через нього по черзі витягують з кожного боку яйцеводи, яєчники і кінці рогів матки. За кількістю жовтих тіл в яєчниках визначають число овуляцій, а також загальний стан статевих органів.
Таблиця 5.7. Час від введення препаратів до настання рефлексу змикання повік і тривалості наркозного сну
Час від введення
Тривалість наркозного сну, хв.
аміназину до змикання повік, хв
хлоралгидрата до настання сну, хв.
Промивають яйцеводи і кінці рогів матки. З цією метою з боку воронки яйцевода вставляють еластичний венозний катетер зовнішнім діаметром 1 мм на глибину 7-8 см і фіксують його пальцями. Через прокол у стінці кінця роги матки вставляють металевий молочний катетер і фіксують його тут в статичному положенні.
Найбільш ефективним є промивання ділянки матки через 72 години після запліднення на відстані 10-15 см від істмуса, т. Е. Межі матково-трубного зчленування. Використання такого способу дозволяє отримати 90% 4-8 клітиннихзародків на 1 донора, в розрахунку від загального числа овуляцій. З них придатних до пересадження 89%.
Існують 2 методи проведення ембріопересадок у свиней:
1. венозний катетер діаметром 1 мм на глибину 8 см в яйцепровід (безкровний метод).
2. В кінець рогів матки, шляхом попереднього хірургічного проколу їх стінки (гострий метод).
Більш високий відсоток поросності (на 17%, 55 проти 35) встановлено у свиноматок реципієнтів після пересадки їм зародків в яйцепровід.
Таблиця 5.8. Приживляемость зародків в залежності від місця пересадки
Нехірургічний метод трансплантації ембріонів у корів.
Нехірургічний метод трансплантації ембріонів включає 7 послідовних технологічних елементів:
1. Відбір корів донорів і реципієнтів (на 1 донора 3 реципієнта).
2. Гормональна індукція полювання і поліовуляції у корів-донорів. Синхронізація полювання у реципієнтів.
3. Виявлення полювання і 3-х кратне осіменіння донорів. Реципієнтів виявили полювання не запліднюють.
4. Нехірургічне витяг ембріонів 2-х канальним катетером Фоллея.
5. Оцінка якості ембріонів, їх криоконсервация, зберігання і транспортування.
6. Відбір і підготовка тварин - реципієнтів, які виявили синхронну з донорами полювання (після гормональної стимуляції або спонтанно).
7. Нехірургічна пересадка розморожених ембріонів реципієнтам спеціальним металевим катетером, після попередньої мікроскопічної оцінки їх якості, або з використанням методу прямої пересадки (без оцінки якості), т. Е. Відразу після відтавання пайєт.
8. Отримання і вирощування телят: бичків для Госплемпредпріятій республіки; теличок - на ремонт дійного стада у господарстві.
Іншим визначальним фактором при відборі донорів є стан репродуктивних органів. При цьому інволюція матки повинна бути повністю завершена і, крім того, в яєчниках виявлятися жовті тіла статевого циклу або розвиваються фолікули. Рекомендується для гормональної обробки відбирати тварин не раніше, ніж через 3 місяці після отелення.
Як реципієнтів частіше використовують клінічно здорових телиць з відгодівлі, т. Е. Які не становлять племінної цінності, у віці 16-18 міс. і живою масою 380-400 кг.
Для викликання поліовуляції у корів-донорів використовують такі гонадотропні препарати:
1. Гонадотропін СЖК під назвою фоллігон (Голландія) і відноситься до плацентарних гормонів (табл. 5.9).
2. Фолликулостимулирующий гормон, під названіемФСГ-супер (Росія), який відноситься до гіпофізарний гормонів (табл. 5.10).
3. Для синхронізації статевих циклів у донорів і реципієнтів застосовують також гормональні препарати простагландинового ряду: просольвін (Голландія), магестрофан (Росія), в дозе2-3 мл на 1 обробку.
Табл. 5.9. Схема обробки корів-донорів фоллігоном
Основні технологічні прийоми роботи фахівців:
1. Попередня ректальная оцінка статевих органів донорів на наявність жовтих тіл в яєчниках, які добре пальпуються вже починаючи через 4 дні після овуляції фолікулів (т. Е. Оцінка реакції на гормональну обробку).
2. Визначення стану матки і її розмірів. Після завершення інволюції матка має добре виражену скоротливу реакцію на її пальпацію (ригідність), щільну консистенцію і добре захоплюється в руку дослідника.
3. Обробка робочих столів і микроско-пов 96% спиртом - ректифікатом, а рук фахівців - 70%. Стерильність в боксі підтримується за допомогою бактерицидних ламп. Для роботи використовується заздалегідь підготовлена стерильна посуд, а також спеціальний одяг і взуття.
4. Витяг ембріонів проводять на 7 день після осіменіння корів-донорів. Для цього використовують катетер Фоллея.
5. Пошук ембріонів під мікроскопом проводять при 20-кратному збільшенні, остаточну оцінку при 100-кратному. Цю роботу проводять в стерильних умовах в спеціальному приміщенні - боксі стацііонарного пункту трансплантації. Маніпуляції з ембріонами з моменту їх отримання і до пересадки займають близько 2 годин (рис. 5. 9).
6. Перед транспортуванням пайєти з ембріонами заправляють в катетер для пересадки (рис. 5.10), поміщають в санітарний чохол і фіксують під одягом в спеціально вшити в халаті внутрішній кишені. Правильність заправки контролюють по утворюється краплі на кінці катетера після натискання на поршень.
7. нехірургічна пересадку ембріонів проводять на 7 день, відразу після вилучення у донорів. У цей період статеві органи тварини найбільш сприйнятливі до інфекції, тому при пересадці необхідно суворо дотримуватися правил асептики.
8. У реципієнтів перевіряють виражений-ність жовтого тіла в яєчнику, яке пальпується у формі грибовидной опуклості на його поверхні. Якщо воно слабо виражене або відсутній, то таку тварину виключають з числа реципієнтів.
9. Перед пересадкою тварині роблять сакральну анестезію, використовуючи для цього 4 мл 2% розчину новокаїну, для попередження скорочення матки в період пересадки ембріонів.
Технологічні переваги нехірургічного методу
Нехірургічний метод у світовій практиці є досить перспективним, оскільки забезпечує:
1. Можливість отримання ембріонів безпосередньо на фермі, а не в стаціонарних операційних.
2. Відсутність необхідності проведення загального наркозу і ймовірності післяопераційних ускладнень.
3. Простоту у виконанні.
4. Можливість без особливого ризику для майбутньої плодючості використовувати корів-донорів повторно.
Основні технологічні елементи підготовки корів-донорів
і техніка вилучення ембріонів:
1. Тварина фіксують в стійлі на ланцюгу, звільняють пряму кишку від калових мас.
2. Зовнішні статеві органи і внутрішню частину хвоста ретельно миють теплою водою з милом, обробляють розчином фурациліну (1: 1000).
3. Для вилучення ембріонів з рогів матки використовують катетер Фоллея (рис. 5. 11).
Мал. 5. 11. Катетер Фоллея для вилучення ембріонів у корів
Катетер складається з гумової трубки (1), надувного балончика (2), чотирьох отворів (3), розташованих один від одного на різних відстанях, що забезпечують оптимальну поверхню введення і виведення промивної середовища. Кінець робочого частини трубки (1) залитий гумою (4), всередині якої є канал для фіксації кінчика металевого стилета (5) і запобігання можливого проколу їм стінки закритої частини катетера і тканини роги матки.
Надувний балончик (2), робочий стан якого показано пунктиром, поміщається на гумовій трубці з припаюванням на кінцях (6) і з надувним каналом (7), має висновок назовні (8). Кінцева частина надувного каналу виконана у вигляді розширеної форми (9). Зовнішній кінець гумової трубки розширено, і в нього вставляється металевий перехідник (10), який має замкóвий вузол для фіксації стилета в гумовій трубці за допомогою нарізного сполучення головки стилета (11) з кінцевою частиною металевого перехідника, вставленого в трубку.
Фактори, що впливають на життєздатність ембріонів
при пересадці їх реципієнтам.
Значні відмінності в результатах приживлюваності ембріонів в рогах матки пов'язані з наступними основними факторами:
- Пересадка ембріонів ближче до початкової частини входу в ріг матки дає порівняно нижчі результати їх приживлюваності у реципієнтів, ніж при пересадці в верхівку. Основною причиною цього може бути велика забезпеченість прогестероном цій галузі матки через кровоносне судини, що сприяє посиленню секреції маткових залоз і, тим самим, забезпечує краще харчування ембріона в перші тижні життя. Результати пересадки в різні ділянки матки представлені в таблиці 5. 11.
Таблиця 5. 11. Результативність трансплантації ембріонів в залежності від місця пересадки
Вік ембріона, днів