Цей метод більш універсальний. Кількість вірусу (титр вірусу) при цьому вимірюється в ефективній 50% дозі - ЕД50.
1 ЕД50 = доза вірусу, здатна викликати інфекційний ефект у 50% заражених тест-об'єктів.
Для кожного вірусу підбирають чутливий до нього тест-об'єкт - лабораторні тварини (зазвичай білі миші), курячі ембріони або культура клітин. Інфекційний ефект або дію вірусу на різних тест-системах може проявлятися загибеллю, клінічними симптомами, патолого змінами і цитопатическим ефектом. У лабораторних тварин і курячих ембріонів дію вірусу оцінюється в летальної і інфекційної дозах:
1 ЛД50 - доза вірусу, що вбиває 50% лабораторних тварин;
I ЕЛД50 - доза вірусу, що вбиває 50% курячих ембріонів;
1 ІД50 - доза вірусу, що викликає клінічні симптоми або патологоанатомічні зміни у 50% заражених лабораторних тварин;
1 ЕІД50 - доза вірусу, що викликає патологоанатомічні зміни у 50% заражених курячих ембріонів.
У культурі клітин дію вірусу оцінюється по цитопатичної ефекту або дії (ЦПД):
1 ЦПД50 - доза вірусу, що викликає цитопатичної ефект в 50% пробірок із зараженою культурою клітин.
Кількість ЕД50 (ЛД50, ЕЛД50, ІД50, ЕІД50 і ЦПД50) вірусу, що міститься в одиниці об'єму віруссодержащего матеріалу, буде вираженням титру вірусу в цьому матеріалі. Так, запис Т = 103.48 ЦПД50 / 0,1 мл означає, що в кожному 0,1 мл віруссодержащего матеріалу міститься 103.48 доз, кожна з яких здатна викликати цитопатичної ефект в 50% пробірок з культурою клітин.
Метод титрування вірусів по 50% інфекційного дії придатний для титрування практично будь-якого вірусу, якщо підібрати чутливу до нього живу тест-систему. Недоліком є трудомісткість, тривалість і необхідність статистичного розрахунку.
Методика визначення титру вірусу в одиницях 50% інфекційного дії (ЛД50, ЕЛД50, ІД50, ЕІД50 і ЦПД50) полягає в тому, щоб знайти таке розведення випробуваного віруссодержащего матеріалу, в обсязі, що заражає дози якого містилася б одна ЕД50, а потім розрахувати, скільки таких одиниць вірусу міститься в такому ж обсязі віруссодержащего матеріалу. Це і буде титр вірусу. Для цього:
1) з досліджуваного віруссодержащего матеріалу готують ряд послідовних 10-кратних розведень. Кількість розведень необхідно робити більше (тобто стільки, щоб останнє найбільш високе вже не давало інфекційного ефекту зовсім). Для 10 послідовних розведень в кожну з 10 стерильних пробірок наливають по 9 мл стерильного фізіологічного розчину, а потім в першу вносять рівно 1 мл досліджуваної суспензії. Перемішують вміст першої пробірки, набирають 1 мл суміші і вносять у другу пробірку, перемішують вміст і 1 мл з другої пробірки - в третю, і т. Д,
2) однаковими обсягами кожного розведення віруссодержащего матеріалу заражають чутливих до даного вірусу живих тест-об'єктів. У кожній їх групі потрібно не менше 4-6 тест-об'єктів (для статистичної достовірності);
3) після закінчення часу враховують результат дії вірусу на заражені об'єкти (загибель, захворювання, патологоанатомічні зміни або цитопатичної ефект). Загибель лабораторних тварин, КЕ вперше 48 годин вважають неспецифічної. Облік закінчують через 2 -3 доби після припинення відмінка;
4) визначають, в якому розведенні вірус проявив свою дію на 50% чутливих об'єктів. Дія вірусу визначають в ЛД50, ЕЛД50, ІД50, ЕІД50 і ЦПД50. Вважають, що доза в цьому розведенні відповідає 1 ЕД50. Дозу вірусу підраховують різними методами (по Ріду і Менчу, Кербер).
Для проведення титрування з досліджуваного віруссодержащего матеріалу готують ряд послідовних десятикратних розведень від 1:10, тобто 10 -1 до 1: 10.000.000, т. Е. 10 -7. і більше (10 -1. 10 -2. 10 -3. 10 -4. 10 -5 і т.д.). Кількість розведень залежить від передбачуваного титру вірусу, їх потрібно готувати стільки, щоб останнє (найбільш висока) розведення вже не давало б інфекційного ефекту. Інфекційне дію вірусу (величина інфекційного ефекту) з кожним розведенням убуває пропорційно логарифму розведення (або дози). Тобто при розведенні 1: 100 (10 -2) інфекційне дію зменшується в два рази, якщо 1: 1000 (10 -3) в три рази і т. Д.
Кожним розведенням досліджуваного віруссодержащего матеріалу в певному однаковому обсязі заражають рівні групи чутливих до даного вірусу живих тест-об'єктів (лабораторних тварин, курячі ембріони, культури тканин). При цьому враховують тропізм і дози вірусу, загальноприйняті для даного способу введення матеріалу. У кожній групі повинно бути не менше 4-6 тест-об'єктів, т. К. При меншій кількості статистична обробка матеріалу матиме дуже велику похибку.
Однак, при визначенні титру вірусу дуже важко підібрати такі розведення, щоб одне з них в точності викликало б загибель 50% заражених тварин. Часто при титруванні кількість живих і полеглих тварин буває нерівним. В цьому випадку для більш точного визначення титру широко використовують в вірусології метод, запропонований Рідом і Менчу. Вони рекомендують при титруванні брати в досвід велика кількість груп по 4-6 чутливих моделей в кожній групі. Відхилення від дійсної величини ЛД50, обумовлене застосуванням малої кількості піддослідних тварин в групі, виправляється тим, що при обчисленні відсотка летальності оперують даними кумулятивної летальності (кумуляція - нагромадження).
Метод Ріда і Менчи заснований на логічній передумові про те, що тварини (і інші моделі), загиблі при зараженні будь-яким розведенням вірусу, наприклад 10 -5. загинуть і при зараженні більш низьким розведенням (10 -4. 10 -3) вірусу. Якщо ж тварина не впало при даному розведенні, то залишиться живим і при зараженні більш високим розведенням (10 -6. 10 -7). На цій підставі отримані результати піддають інтерполяції і висловлюють їх у вигляді кумулятивних даних, на підставі яких розраховують% летальності.
При обчисленні кумулятивних даних мишей, полеглих від вищого розведення, додають до числа загиблих від нижчого розведення. Мишей, які залишилися живими від нижчого розведення, додають до числа тварин, які не загинули від вищого розведення (напрямок показано стрілкою). Після отримання кумулятивних даних визначають% летальності. Відсоток летальності для кожного розведення обчислюють за формулою:
% Летальності = Кількість полеглих (кумулятивні дані) / Кількість заражених (кумулятивні дані) х 100
Розведення, при яких% летальності наближаються до 50%, називають вищої школи й нижчою критичної дозою.
ЛД50 визначають за формулою:
,
де ЛД50 - шукане розведення вірусу; В - розведення, що викликає загибель понад 50% тварин; b - відсоток летальності, відповідний розведення В; а - відсоток летальності, відповідний розведення, що дає загибель щонайменше 50% тварин; d - коефіцієнт розведення.
Титр вірусу, виражений числом з дробовим показником ступеня, зазвичай у такому вигляді і залишають. Його можна легко перетворити і в абсолютну величину за допомогою таблиці антилогарифмів (4-х значні математичні таблиці Брадіса). По таблиці антилогарифмів знаходять абсолютне значення розведення, відповідне 1 ЛД50.