Лабораторна робота № 2
Реакції оборотного осадження білків
Реакції осадження білків бувають оборотними і необоротними. При оборотному осадженні макромолекули білка в основному не піддаються глибокої денатурації, а опади можуть бути знову розчинені в первісному розчиннику. Оборотне осадження викликається дією нейтральних солей амонію, лужних і лужно-земельних металів (висолювання), спирту, ацетону, ефіру і деяких інших органічних розчинників.
Реактиви: розчин яєчного білка з додаванням хлориду натрію (білок одного курячого яйця відокремлюють від жовтка і розчиняють в 230 см 3 дистильованої води, до якої додають 100 см 3 насиченого розчину хлориду натрію, розчин фільтрують через марлю, складену в 3-4 шари, і зберігають в холодильнику); насичений розчин сульфату амонію; сульфат амонію, розтертий в порошок; 10% -й розчин гідроксиду натрію; 1% -й розчин сульфату міді.
Обладнання: пробірки; воронка для фільтрування; паперові фільтри.
Завдання 1. Осадження білків сульфатом амонію.
- В пробірку відміряйте 2-3 см 3 розчину яєчного білка, додайте рівний об'єм насиченого розчину сульфату амонію і суміш перемішайте.
- Випадає осад глобулінів, альбуміни залишаються в розчині. Осад відфільтруйте на паперовому фільтрі.
- До фільтрату додайте порошок сульфату амонію до отримання насиченого розчину (остання порція розчиняється).
- Випадає осад альбумінів, який також відфільтруйте.
- Фільтр з осадом альбумінів промийте 5 см 3 води, збираючи фільтрат в чисту пробірку.
- Проробіть з фільтратом біуретову реакцію. Чи відбулося розчинення альбуміну?
Завдання 2. Осадження білків спиртом.
Органічні розчинники викликають осадження білків внаслідок руйнування гідратної оболонки макромолекул.
- У пробірку налийте 1 см 3 розчину яєчного білка з додаванням хлориду натрію.
- По краплях долийте 4-6 см 3 спирту і сильно збовтайте. Через 5-8 хв. випадає осад білків.
При незворотному осадженні відбувається глибока денатурація і агрегація білка. Денатурований білок не здатний до відновлення своїх початкових фізико-хімічних і біологічних властивостей. Необоротне осадження викликається високою температурою, дією концентрованих мінеральних і деяких органічних кислот, іонів важких металів, алкалоїдних реагентів, детергентів, барвників.
Реактиви: водний розчин яєчного білка (розчин готують, як зазначено в лабораторній роботі №1; концентровані сірчана, соляна і азотна кислоти; 5% -й розчин ацетату свинцю; 2,5% -й розчин нітрату срібла; 5% -й розчин сульфату міді.
Завдання 1. Осадження білків мінеральними кислотами.
Реакція знаходить застосування для швидкого визначення білка в біологічних рідинах, наприклад, сечі.
Дану роботу необхідно виконувати у витяжній шафі, дотримуючись особливої обережності!
- У три пробірки налийте по 15-20 крапель концентрованих кислот: в першу - сірчаної; в другу - азотної і в третю - соляної.
- Пробірки нахиліть під кутом 45 о і ОБЕРЕЖНО (з піпетки) нашарувалися по стінці розчин білка. Пробірку тримайте отвором від себе. На кордоні білка і кислоти з'являється біле кільце.
- Пробірки обережно струсіть. Опади розчиняються в сірчаної та соляної кислоти, але не розчиняються в азотній кислоті.
Завдання 2. Осадження білків солями важких металів.
Білки осідають солями міді, свинцю, ртуті, цинку, срібла і інших важких металів. Властивість білків зв'язувати іони важких металів використовується в медицині при наданні першої допомоги постраждалим від отруєння солями міді, свинцю, ртуті.
- У три пронумеровані пробірки налийте по 5-10 крапель розчину білка.
- В першу пробірку по краплях додайте розчин ацетату свинцю. Утворюється осад. Додайте ще кілька крапель, осад повинен розчинитися в надлишку розчину солі.
- У другу пробірку по краплях доливають розчин нітрату срібла. Осад, що утворився в надлишку солі розчиняється.
- У третю пробірку додайте розчин сульфату міді до появи осаду. Переконайтеся, що осад розчиняється в надлишку солі.
Оформіть результати проведених досліджень у вигляді таблиці.
Теплова денатурація білка
При нагріванні білки денатурують. На процес денатурації роблять сильний вплив рН розчину і додавання електролітів.
Реактиви: водний розчин яєчного білка (розчин готують, як зазначено в лабораторній роботі №1); 1% -й розчин оцтової кислоти; 10% -й розчин оцтової кислоти; 10% -й розчин гідроксиду натрію; насичений розчин хлориду натрію.
Обладнання: пробірки, водяна баня або спиртівка.
- О п'ятій пронумерованих пробірок налийте по 10 крапель розчину яєчного білка.
- Білок в першій пробірці нагрійте до кипіння. Розчин мутніє (руйнуються гідратів оболонки навколо макромолекул), але осад не утворюється. Міцели, утворені макромолекулами, зберігають однойменний заряд, що перешкоджає їх осадженню.
- До розчину білка в другій пробірці додайте одну краплю 1% -го розчину оцтової кислоти і нагрійте до кипіння. Осад білка випадає швидко. Заряд мицелл нейтралізований і білок близький до ізоелектричної точці.
- До розчину білка в третій пробірці додайте 1-2 краплі 10% -ого розчину оцтової кислоти і нагрійте до кипіння. Осад не утворюється, так як міцели білка придбали, приєднуючи іони водню, позитивний заряд, що перешкоджає їх осадженню.
- У четверту пробірку додайте 1-2 краплі 10% -го розчину гідроксиду натрію і нагрівайте до кипіння. Осад не випадають. Міцели за рахунок відщеплення протонів від карбоксильних груп бічних ланцюгів білка заряджені негативно.
- У п'яту пробірку додайте 1-2 крапель насиченого розчину хлориду натрію і нагрівайте до кипіння. Білок випадає в осад.
Оформіть результати дослідження, заповнивши таблицю і коротко записавши механізм денатурирующего дії досліджуваного фактора у вигляді висновку.