Бактеріологічний метод дослідження (БЛМІ) - метод, заснований на виділенні чистих культур бактерій за допомогою культивування на поживних середовищах і їх ідентифікації до виду на підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, генетичних, серологічних, біологічних, екологічних характеристик мікроорганізмів.
Бактеріологічну діагностику інфекцій проводять, використовуючи стандартні діагностичні схеми, затверджені Міністерством охорони здоров'я.
Чистий культура - бактерії одного виду, вирощені на поживному середовищі, властивості яких знаходяться в процесі вивчення.
Штам - ідентифікована чиста культура мікроорганізмів одного виду, виділена з певного джерела в певний час. Штами одного виду можуть несуттєво відрізнятися біохімічними, генетичними, серологічними, біологічними та ін. Властивостями, а також місцем і часом виділення.
1. Постановка етіологічного діагнозу: виділення чистої культури мікроорганізмів і її ідентифікація.
2. Визначення додаткових властивостей, наприклад, чутливості мікроорганізму до антибіотиків і бактеріофагів.
3. Визначення кількості мікроорганізмів (важливо в діагностиці інфекцій, що викликаються УПМ).
4. Типування мікроорганізмів, т. Е. Визначення внутрішньовидових відмінностей на підставі вивчення генетичних та епідеміологічних (фаговаров і сероварів) маркерів. Це використовується в епідеміологічних цілях, т. К. Дозволяє встановити спільність мікроорганізмів, що виділяються від різних хворих і з різних об'єктів зовнішнього середовища, в різних стаціонарах, географічних регіонах.
БЛМІ включає кілька етапів, різних для аеробів, факультативних анаеробів і облігатних анаеробів.
I. Етапи БЛМІ при виділенні чистої культури аеробів і факультативних анаеробів.
А.Забор, транспортування, зберігання, попередня обробка матеріалу. Іноді до посіву проводять селективну обробку матеріалу з урахуванням властивостей виділяється мікроорганізму. Наприклад, перед дослідженням мокротиння або іншого матеріалу на присутність кіслотустойчівих мікобактерій туберкульозу, матеріал обробляють розчинами кислот або лугів.
Б. Посів в середу збагачення (при необхідності) .Його проводять, якщо в досліджуваному матеріалі міститься мала кількість бактерій, наприклад, при виділенні гемокультури. Для цього кров, узяту на висоті лихоманки в великому обсязі (8-10 мл у дорослих, 4-5 мл у дітей) засівають в середу в співвідношенні 1:10 (для подолання дії бактерицидних чинників крові); посів інкубують при температурі 37 0 С 18-24 ч.
В. Мікроскопія досліджуваного матеріалу. З досліджуваного матеріалу готують мазок, фарбують його за Грамом або іншим методом і проводять мікроскопію. Оцінюють присутню мікрофлору, її кількість. В ході подальших досліджень повинні бути виділені мікроорганізми, присутні в первинному мазку.
Г. Посів на поживні середовища з метою отримання ізольованих колоній. Проводять посів матеріалу петлею або шпателем методом механічного роз'єднання на чашку з диференційно-діагностичної або селективної середовищем з метою отримання ізольованих колоній. Після посіву чашку перевора-ють дном догори (щоб уникнути розмазування колоній крапельками конденсаційної рідини), підписують і поміщають в термостат при температурі 37 0 С на 18-24 год.
Слід пам'ятати, що при посівах і пересіву мікробних культур увагу працюючого повинна бути звернена на дотримання правил асептики для попередження контамінації поживних середовищ і попередження зараження оточуючих і самозаражения!
У разі інфекцій, що викликаються умовно-патогенними мікроорганізмами, де має значення кількість присутніх мікроорганізмів в патологічному матеріалі, роблять кількісний посів матеріалу, для чого попереднього готують ряд 100-кратних розведень матеріалу (зазвичай 3 розведення) в стерильному фізіологічному розчині хлориду натрію в пробірках. Після чого по 50 мкл кожного розведення висівають на живильні середовища в чашках Петрі.
А. Вивчення морфотипов колоній на середовищах, їх мікроскопія. Переглядають чашки і відзначають оптимальну живильне середовище, швидкість росту, характер росту мікроорганізмів. Для вивчення вибіраютізолірованние колонії, розташовані по ходу штриха, ближче до центру. Якщо виростає кілька типів колоній - кожен досліджується окремо. Оцінюють ознаки колоній (табл. 7). При необхідності чашки з посеваміпросматрівают через лупу або за допомогою мікроскопа з об'єктивом малого збільшення і звуженої діафрагмою. Вивчають тинкторіальних властивості відрізняються морфотипов колоній, для цього з частини досліджуваної колонії готують мазок, фарбують за Грамом або іншими методами, микроскопируют і визначають морфологію чистоту культури.Прі необхідності ставлять орієнтовну РА на склі з полівалентними сироватками.
Б. Накопичення чистої культури. Для накопичення чистої культури ізольовані колонії всіх морфотипов пересівають в окремі пробірки зі скошеним агаром або будь-якої іншої живильним середовищем і інкубують в термостаті при +37 0 С (така температура оптимальна для більшості мікроорганізмів, але може бути й інший, наприклад, для Campylobacterium spp . - +42 0 C, Candida spp. і Yersinia pestis - +25 0 C).
Як середовище накопичення для ентеробактерій зазвичай використовують середу Кліглера.
Склад середовища Кліглера: МПА, 0,1% глюкози, 1% лактози, реактив на сірководень (сірчанокисле залізо + тіосульфат натрію + сульфіт натрію), індикатор феноловий червоний. Початковий колір середовища малиново-червоний, середа «скошена» в пробірках: має стовпчик (2/3) і скошену поверхню (1/3).
Посів в середу Кліглера проводиться штрихом по поверхні і уколом в стовпчик.
А. Облік зростання на середовищі накопичення, оцінка чистоти культури в мазку по Граму.Отмечают характер росту виділеної чистої культури. Візуально чиста культура характеризується однорідним зростанням. При мікроскопічному дослідженні забарвленого мазка, приготовленого з такої культури, в ньому в різних полях зору вияв-ються морфологічно і тинкторіальними однорідні клітини. Однак в разі вираженого плеоморфізм, властивого неко-менту, котрим видам бактерій, в мазках з чистої культури можуть зустрічатися одночасно клітини з різною морфологією.
Якщо в якості середовища накопичення використовували індикаторну середу Кліглера, то оцінюють зміни її кольору в стовпчику і скошеної частини, за якими визначають біохімічні властивості: ферментацію глюкози, лактози і продукцію сірководню. При розкладанні лактози жовтіє скошена частина середовища, при розкладанні глюкози - жовтіє стовпчик. При утворенні CO2 в процесі розкладання цукрів утворюються газові бульбашки або розрив стовпчика. У разі продукції сірководню відзначається почорніння по ходу уколу через перетворення сульфату заліза в сульфід заліза.
Характер зміни кольору середовища Кліглера (рис. 23) пояснюється неоднаковою інтенсивністю розщеплення мікроорганізмами азотистих речовин і освіти лужних продуктів в аеробних (на скошеної поверхні) і анаеробних (в стовпчику) умовах.
В аеробних умовах на скошеної поверхні відбувається більш інтенсивне щелочеобразованіе, ніж в стовпчику середовища. Тому при розкладанні глюкози, яка присутня в середовищі в невеликій кількості, що утворюється на скошеної поверхні кислота швидко нейтралізується. У той же час при розкладанні лактози, яка присутня в середовищі у високій концентрації, лужні продукти не здатні нейтралізувати кислоту.
В анаеробних умовах в стовпчику лужні продукти утворюються в незначній кількості, тому тут виявляється ферментація глюкози.
Мал. 23. Індикаторна середу Кліглера:
2 - з ростом E. coli,
3 з ростом S. paratyphi B,
4 -з зростанням S. typhi
E. coli розкладають глюкозу і лактозу з газоутворенням, що не продукують сірководень. Вони викликають пожовтіння стовпчика і скошеної частини з розривами середовища.
S. paratyphi розкладають глюкозу з газоутворенням, лактозоотріцательни. Вони викликають пожовтіння стовпчика з розривами, скошена частина не змінює колір і залишається малиновою. При цьому S. paratyphi B продукують сірководень (по ходу уколу з'являється чорне забарвлення), S. paratyphi A сірководень не продукує.
S. typhi розкладають глюкозу без газоутворення, лактозоотріцательни, продукують сірководень. Вони викликають пожовтіння стовпчика без розривів, скошена частина не змінює колір і залишається малиновою, по ходу уколу з'являється чорне забарвлення.
Shigella spp. глюкозопозітівни, лактозоотріцательни, що не продукують сірководень. Вони викликають пожовтіння стовпчика (з розривами або без них в залежності від серовара), скошена частина не змінює колір і залишається малиновою.
Б. Остаточна ідентифікація чистої культури (визначення систематичного положення виділеного мікроорганізму до рівня виду або варіанти) і визначення спектру чутливості виділеної культури до антибіотиків.
Для ідентифікації чистої культури на цьому етапі вивчають біохімічні, генетичні, серологічні і біологічні ознаки (табл. 8).
У рутинної лабораторної практиці при ідентифікації немає необхідності вивчати всі властивості. Іспользуютінформатівние, доступні, прості тести, достатні для визначення видової (варіантної) приналежності виділеного мікроорганізму.