Головна | Про нас | Зворотній зв'язок
Гістологічна техніка - це техніка приготування гістологічного препарату. Гістологічним препаратом може бути зріз органу, тканини, мазок, відбиток, плівковий препарат, культура тканин. У всіх випадках гістологічний препарат повинен відповідати таким вимогам:
1. Бути прозорим, тобто пропускати потік світла. Для цього ізготав-ливают досить тонкі зрізи органів, тканин, клітин.
2. Бути контрастним, що досягається фарбуванням препарату.
3. Бути постійним, тобто зберігатися тривалий час і служити в ка-честве своєрідного документа.
Всі ці вимоги до гістологічного препарату і виконуються в ході гістологічної техніки.
Гістологічна техніка включає в себе кілька етапів: 1. Взяття матеріалу:
- під час операції;
- від експериментальних тварин;
- шляхом пункційної біопсії;
- взяття крові, червоного кісткового мозку шляхом пункції;
- приготування відбитків (з порожнини рота, піхви та ін.). 2. Фіксація матеріалу.
Фіксація отриманого гістологічного матеріалу - це вплив на нього хімічними речовинами, а також фізичними факторами, що перешкоджає подальшому руйнуванню тканин об'єкта, зберігає його структуру. Фізичні фіксують чинники - заморожування (твердої вуглекислотою, в рідкому азоті, кисні і т.д.), вплив високої тим-ператури, рентгенівське опромінення. Всі ці фактори викликають загибель бактерій і інактивують власні ферменти тканин, сприяючи со-зберігання гістологічного матеріалу. Хімічні фіксатори також ви-викликають загибель мікробів і власних ферментів тканин, стабілізують структуру об'єкта. Розрізняють прості і складні хімічні фіксатори. Прості фіксатори складаються з однієї хімічної речовини (наприклад, формалін, спирт, оцтова кислота та ін.). Ці фіксатори, однак, приво-дять до певних порушень структури гістологічного матеріалу. Так, формалін викликає зморщування його, зменшення в розмірах. Оцет-ва кислота, навпаки, викликає набухання. Тому частіше застосовують складні фіксатори, в яких негативний вплив простих фіксатив-рів нівелюється. Наприклад, фіксатор ФСУ складається з 4 частин форма-лина, 1 частини спирту і 0,3 частин оцтової кислоти. Цей фіксатор викли-кість вельми незначні зміни структури об'єкта. Відомо мно-дружність і інших складних фіксаторів.
Для вимивання фіксатора з тканин використовують воду або інші ве-щества (спирт).
З об'єкта видаляють воду шляхом поміщення його в спирти возрастаю-щей концентрації, а потім в хлороформ.
Проводиться для того, щоб з об'єкта можна було приготувати тон-кі зрізи. Виконується шляхом заливання в парафін, целлоидин або целлоідінпарафін. Можна ущільнити матеріал і шляхом заморожування в жид-ком азоті, що використовується в гистохимии ферментів. При цьому зберігають-ся інтактними всі ферменти.
6. Виготовлення зрізів.
Цей етап виконується за допомогою приладів мікротомів (рис. 2.8). У них використовуються дуже гострі ножі, які закріплюються-рухомо. Об'єкт, залитий в парафін, рухається вперед протягом каждо-го циклу (обороту) на певну відстань (3-10 мкм), і з його повер-хности зрізаються зрізи такої ж товщини (ротаційний мікротом). У мікротомів інших конструкцій (санні мікротоми) нерухомо закреп-ляется об'єкт, а ніж рухається вільно вперед-назад в горизонтальній площині і після кожного циклу рухів опускається на задану тол-щину, виробляючи зрізи.
Видалення з зрізів парафіну.
Зрізи поміщаються на предметне скло, підсушують і поміщаються в розчинник парафіну - ксилол, толуол, бензол або в інші ве-щества.
За допомогою фарбування досягається контрастність препаратів. Для цього використовують барвники. Залежно від джерела отримання вони поділяються на барвники тваринного, рослинного походження, синтетичні. Крім того, всі барвники діляться на кислі (утворені кислотами), основні (утворені підставами) і нейтральні.
Прикладом кислого барвника може служити еозин, який є синтетичні-ного барвником. Приклад основного барвника - гематоксилин. Він по-променя з кори деяких порід дерев (кампешевое дерево).
Барвники діляться також на цитоплазматичні (фарбують цітоп-лазму клітини, наприклад, еозин) і ядерні (фарбують ядро, наприклад, гематоксилин, АЗУР і ін.).
Тинкторіальних властивості ТКАНЕЙ. Під тинкторіальних властивостями розуміють здатність тканин і клітин фарбуватися барвника-ми. Для позначення тіпкторіальних властивостей використовують такі терміни:
1. ОКСІФІЛІЯ - це здатність клітин і тканин забарвлюватися кислими барвниками. Самі структури при цьому мають основні свій-ства. Наприклад, еритроцити мають оксіфіліей за рахунок вмісту в них основного білка гемоглобіну.
2. еозинофіли (варіант оксіфіліі) - здатність структур забарвлюватися кислим барвником еозином. Еозинофілією володіє ци-топлазме багатьох клітин.
3. ацидофілія - те саме, що і оксіфілія.
4. базофілів - здатність структур забарвлюватися основними барвниками. При цьому самі структури повинні мати кислу реакцію. Наприклад, нуклеїнові кислоти (ДНК і РНК) мають базофілія, тому що по хімічним законам можуть пов'язувати барвники-підстави. Благо-даруючи цьому ядро будь-якої клітини в тій чи іншій мірі базофильно. Базо-філією володіє також цитоплазма белоксінтезірующіх клітин через спів-тримається в численних рибосомах РНК.
5. Поліхроматофілія - здатність структур клітини пофарбовані-тися і кислими, і основними барвниками. Таким якістю володіють, наприклад, гранули нейтрофільних лейкоцитів. Найчастіше, однак, як синонім використовують термін нейтрофілів.
6. метахромазії - здатність гістологічних структур при зв'язуванні барвника змінювати його колір. При цьому самі структури окра-Шива в колір, який відрізняється від кольору барвника в розчині. Найчастіше метахромазією володіють вуглеводні сполуки, і поява мета-Хромазит говорить про присутність в клітці або тканини складних вуглеводів.
7. АРГЕНТОФІЛІЯ - здатність структур забарвлюватися солями срібла.
8. ХРОМОФІЛІЯ - здатність структур забарвлюватися солями хрому.
9. Висновок, або консервація зрізів.
На зріз наносять краплю синтетичної середовища або канадського бальзаму, а потім покривають покривним склом. Після висихання бальзаму препарат прозорий, може бути підданий вивченню під мікроскопом, спосо-бен довго зберігатися і може використовуватися як своєрідний документ.
ОБРОБКА ОБ'ЄКТІВ ДЛЯ трансмісійної електронної мікроскопії
Обробка гістологічних об'єктів для трансмісійної електрон-ної мікроскопії в принципі складається з тих же етапів, що і описана вище гістологічна техніка: взяття матеріалу, його фіксації, заливки, виготовлення зрізів і їх фарбування, або контрастування. Ці етапи мають свої особливості. Взятий матеріал не повинен перевищувати розміри 2 мм (зазвичай беруть шматочок органу кубічної форми з довжиною ребра 1 мм). Фіксують отриманий матеріал в деяких альдегідах (глутаральде-гід) з додатковою фіксацією (постфіксація) в розчині чотириокис-сі осмію. При постфіксація відбувається одночасне фарбування структур.
Заливка матеріалу проводиться в синтетичні (епоксидні) смо-ли: аралдіт, Епон і ін. Виготовлення ультратонких зрізів товщиною 30-50 їм здійснюється на приладі ультратоме за допомогою спеці-них скляних або алмазних ножів. При цьому спочатку на ультратоме готують напівтонкої зрізи, на яких (після їх забарвлення) в світловому мікроскопі знаходять необхідні для вивчення в електронному мікроскопі ділянки. Далі проводять "заточку" об'єкта - видаляють зайві його учас-тки, залишаючи необхідні. Потім готують остаточні (ультратонкі) зрізи. Фарбування (воно називається контрастуванням) здійснюють за допомогою солей важких металів (урану, свинцю, осмію і ін.). Ці солі в різному ступені зв'язуються зі структурами об'єкта, що забезпечують-кість різну електронну щільність (контрастність) останніх. Пос-ле фарбування ультратонкі зрізи поміщають на металеву сітку і потім вивчають в електронному мікроскопі.
"Для вивчення гістологічного об'єкта в скануючому електронному мікроскопі його спочатку піддають фіксації, потім висушують. Далі на поверхню об'єкта напилюють метали, такі, наприклад, як золото, з тим, щоб вони відображали пучок електронів.