Отже, шотландська авантюра не вирішила жодної проблеми, і центральної королівської влади довелося зіткнутися з відкритим заколотом. Вперше піклувальники нового віровчення показали своє справжнє обличчя в ході подій, які увійшли в історію під назвою Амбуазського змови. Гугенотів в їх прагненні до влади підстьобувала ненависть, яку вони мали до Гизам і королеві-матері: їх вони вважали відповідальними за продовження політики Генріха І, спрямованої на викорінення єресі. Всупереч очікуванням гугенотів, які вважали, що після смерті короля вирок буде скасований, радник парламенту Анн де Бург був спалений на Гревской площі як небезпечний єретик. І тоді вожді гугенотів, якими в той час вважалися брати Бурбони, Антуан і принц Конде, а також племінники конетабля Монморансі, перш за все Гаспар Ко-Ліньі, зважилися на найгірше: захопити короля і вбити, якщо вдасться, Гізов або ж залучити їх до суду як узурпаторів. Катерина пропонувала вжити заходів щодо умиротворення реформатів: видати едикт про амністію протестантів, заарештованих за віру, але не замішаних у збройному змові. Однак ці заходи запізнилися. Тепер треба було діяти інакше.
Королівські загони безперервно патрулювали навколо замку, прочісуючи і навколишні ліси. Одного разу їм вдалося захопити в лісовій гущавині групу бідних селян, які заявляли, що вони хотіли зустрітися з королем, клянучись при цьому в своїй відданості монарху. Франциск II звернувся до них з вікна своєї резиденції, після чого звелів дати їм трохи грошей і відпустити їх додому. Йдучи, селяни повідомили королю, що на підході великий загін озброєних дворян. Одночасно по долині Луари до Амбуаза наближалося численне військо на чолі з Ла Ренодо. Замок був оточений, і ватажок заколотників зажадав зустрічі з королем, проте, на відміну від селян, він не удостоївся такої честі. Зав'язався бій, в ході якого королівське військо під командуванням герцога Гіза звернуло загін Ла Ренодо в втеча, а сам він під час погоні був убитий. Безліч знатних учасників заколоту було захоплено в полон і приведено в Амбуаз.
Їх чекала незавидна доля. За звичаєм того часу їм влаштували у дворі Амбуазського замку показову публічну страту для науки іншим. Королівський двір, отримавши наочне свідчення того, якого розмаху набуває заколот, вирішив, що ця жорстока репресивна міра повинна нагнати страху на тих представників знаті, які схильні були до непокори. Спеціальним королівським розпорядженням всіх нотаблей (членів королівської ради, королівських чиновників і принців крові) долини Луари, від Нанта до Орлеана, зобов'язали бути присутнім на страті, для чого були зведені глядацькі трибуни. Що ж стосується черні, то її і запрошувати не треба було: вона сама валом валила подивитися на криваве видовище.
За сигналом герцога Гіза публічна страта почалася. Засуджені заколотники один за одним піднімалися на ешафот. Решта тим часом хором співали псалми, і хор цей не замовкав протягом усього кари, все більше слабея в міру того, як відрубані голови падали на дошки ешафота. Останнім залишався барон Кастельно, родич Коліньї. Йому довелося співати одному. Це особливо зворушило серця присутніх, і вони почали благати короля пощадити його, але марно. Сокира ката опустився і на шию останнього із засуджених. Конде, звернувшись до сидів по сусідству папського нунція, сказав: «Монсеньйор, ви можете повідомити татові, що якщо французькі дворяни вміють влаштовувати змову, то вони вміють і вмирати». Примітно, що він вжив слово «дворяни», а не «гугеноти»: релігія в цих нібито релігійних війнах мала вторинне значення. У Амбуазе стратили єретиків-гугенотів, а заколотників, що зробили замах на освячену королівську владу, які вчинили непростиме святотатство. Однак гугенотська пропаганда дуже вміло обернула справу на свою користь, зумівши витягнути з провалився Амбуазського змови велику моральну перемогу, представивши Гізов і Катерину Медічі як катів французького народу.