Рослини-біофабрики
Розвиток біотехнологій відкрило нові можливості використання живих організмів на благо людства. Методи генетичної інженерії дозволяють виробляти різні речовини в живих об'єктах, отже, ми можемо використовувати ці об'єкти в якості природних «фабрик». Центральна догма молекулярної біології в загальному випадку говорить: ДНК - РНК - білок. Саме білок часто є кінцевим продуктом біотехнологічного виробництва: це може бути інсулін, інтерферони, антитіла, ферменти, вакцини. Нам лише потрібно задати програму і «записати» її в ДНК, а живий об'єкт все зробить сам. Як «фабрик» використовують клітини дріжджів, бактерій, рослин, а також культури клітин комах і ссавців. У цій статті мова піде про рослинних биофабриках.
Що таке рослина-біофабрика?
Як пояснити поняття «рослина-біофабрика»? Можна сказати, що це природне підприємство, яке буде виготовляти потрібний нам біопродукт. На відміну від звичайної фабрики, на такому підприємстві будуть трудитися не робочі, а компоненти клітин: полімерази нуклеїнових кислот, рибосоми, тРНК і багато інших. А виробляти вони будуть білок.
Чому саме рослини?
В даний час для напрацювання білків найчастіше використовують бактерій, дріжджі, культури клітин комах і ссавців. Дуже привабливою системою синтезу і накопичення рекомбінантних білків (експресійної системою) є і рослини, і тому є кілька причин. Перш за все, в рослинних тканинах немає ризику забруднення рекомбінантного білка вірусами тварин і пріонами - інфекційними білками [1]. Рослинні клітини забезпечують правильну модифікацію рекомбінантного білка, характерну для еукаріотів [2, 3]. Також велике значення мають вартість, простота і час. На малюнку 1 порівнюється кілька основних експресійних систем.
Малюнок 1. Порівняння систем продукції рекомбінантних білків
(Від найпривабливіших «+» до найменш привабливих «-»).
У кожної біофабрики є свої плюси і свої мінуси. Але рослинна система для багатьох ситуацій виявляється найбільш привабливою.
Як змусити рослину виробляти білок?
Для того щоб рослина виробляло потрібний білок, в клітини цієї рослини необхідно внести чужорідний генетичний матеріал - послідовність ДНК, що кодує амінокислотну послідовність потрібного білка.
Перший етап модифікації рослин із застосуванням методів генетичної інженерії включає пошук і виділення (або синтез) генів, які будуть перенесені в рослинний геном. Гени, що представляють інтерес для біотехнологів (цільові гени), можуть бути «вирощені» хімічним шляхом, а також напрацьовані за допомогою ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції). Потім цільової ген вбудовується у відповідний вектор, який і доставляє його до місця виробництва білка - подібно до того, як вагон з сировиною чіпляється до паровоза, що направляється до фабрики.
Як перенести в рослинну клітину необхідну послідовність ДНК?
В даний час частіше використовують два способи.
Перший пов'язаний з використанням природних генно-інженерних «навичок» грунтової агробактерії Agrobacterium tumefaciens, здатної переносити фрагменти ДНК в рослинну клітину, тобто модифікувати її генетично. Цей процес в природі відбувається повсюдно і регулярно. У природній A.tumefaciens крім хромосоми міститься Ti-плазміда. до складу якої входить так звана Т-ДНК (transferred DNA) довжиною 12-22 тисяч пар нуклеотидів, що вбудовуються в ДНК рослинної хромосоми. Вона кодує ферменти синтезу фітогормонів і опинилась - похідних амінокислот, які використовуються бактерією як джерело вуглецю, азоту та енергії.
Т-ДНК Ti-плазмід володіє двома властивостями, що роблять її майже ідеальним вектором для введення чужорідних генів у клітини рослин. По-перше, коло господарів агробактерій дуже широкий: вони трансформують клітини практично всіх дводольних рослин (а при деяких намаганнях можна домогтися зараження і однодольних, в тому числі злаків). По-друге, інтегрована в геном рослини Т-ДНК успадковується як простий домінантний ознака відповідно до законів Менделя. Найпростіший спосіб введення Т-ДНК в клітини рослини - зараження його A.tumefaciens, що містить відповідну Ti-плазміди, подальше ж надається природному ходу подій. Необхідно тільки вміти вбудовувати потрібні гени в Т-сегмент плазмідної ДНК.
Після проникнення агробактерій в міжклітинний простір Т-ДНК переноситься з агробактерії в ядро рослинної клітини і вбудовується в хромосомну ДНК. Далі відбуваються транскрипція і трансляція - синтезується цільовий білок. Сама бактерія в клітку при цьому не проникає, а залишається в міжклітинному просторі.
Другий спосіб - балістична трансформація з використанням генної гармати. Маленькі золоті або вольфрамові частинки покривають чужорідної ДНК і «вистрілюють» в молоді рослинні клітини. Цей метод дозволяє вбудовувати потрібні гени не тільки в хромосоми рослин, але і в геном їх органел - пластид. Це дуже корисно в першу чергу для отримання рослин, захищених від шкідників, але при цьому безпечних для запилювачів, адже трансгени НЕ експресуються в які не мають пластид квітках. Нещодавно у такий спосіб створили трансгенну (а саме - транспластомних) картопля, в хлоропластах якого утворюється і зберігається неушкодженою дволанцюжкова РНК, що блокує синтез життєво важливого білка колорадського жука - бета-актину. Поїдаючи листя такого картоплі, личинки жуків гинуть в лічені дні [6].
Менш поширені, але все ж дієві способи трансформації - електропорація і трансформація за допомогою вірусів.
Постійна і тимчасова експресія гена
У генетичній інженерії рослин можна зустріти такі поняття: генетично модифіковане (ГМ, або трансгенну) рослина і рослина, що забезпечує транзієнтної (тимчасову) експресію гена. У чому ж різниця?
Якщо мова йде про трансгенному рослині, то мається на увазі, що чужорідна ДНК інтегрована в хромосому. До теперішнього часу отримані десятки видів трансгенних рослин, в геном яких перенесена ДНК, що кодує різні білки медичного призначення, такі як антигени різних збудників інфекційних захворювань, терапевтичні білки і моноклональні антитіла [7, 8, 9]. Однак кількість синтезованого цільового білка в таких рослинах зазвичай невелика (менше 1% від загального розчинного білка).
При транзієнтної експресії ДНК зазвичай не включається в ядерний геном, що не реплікується і не передається у спадок. Цей вид експресії не є постійним, проте деякий час в одній клітці може бути присутньою велика кількість копій чужорідної ДНК, що забезпечує високий рівень синтезу кінцевого продукту. При напрацюванні білків в рослинах даний варіант найбільш ефективний. Ми ніби орендуємо фабрику, і це виявляється більш рентабельним, ніж її покупка. На малюнку 2 представлена модель переносу в рослинну клітину ДНК для транзієнтної експресії (в ролі кур'єра - Agrobacterium tumefaciens).
Малюнок 2. транзієнтної експресія чужорідних генів в рослинах за допомогою агроінфільтраціі.
А - загальний механізм процесу, Б - візуалізація синтезованого в рослині репортера -
GFP (зеленого флуоресцентного білка) - освітленням аркуша ультрафіолетом.
Що може виробляти рослина-біофабрика?
Використання рослин в біотехнології розвивається в декількох напрямках (рис. 3).
Малюнок 3. Можливості використання рослин в біотехнологічних цілях.
У цю ж групу можна віднести трансгенні рослини, які використовуються в якості модельних об'єктів для вивчення фундаментальних проблем функціонування генів.
Багато ГМ-рослини зараз знаходяться в масовому виробництві. Це соя, кукурудза, картопля, маслянисті рослини (рапс і соняшник) і багато інших (рис. 4). Країнами-лідерами у виробництві таких рослин є США, Канада, Аргентина і Бразилія. Наздоганяють їх Китай і Японія. З низкою рослин працюють деякі країни ЄС і Австралія.
Малюнок 4. Приклади трансгенних рослин.
Серед компаній, що розробляють трансгенні рослини, можна відзначити Calgen, Monsanto, Ciba Seeds. Незважаючи на те, що ГМ-рослини продаються на багатьох ринках світу, дискусії про безпеку їх використання ще не закінчені. Найбільше чуток і скандалів розгортається навколо компанії «Монсанто». Основна продукція цієї фірми - генетично модифіковане насіння кукурудзи, сої, бавовни, а також найпоширеніший в світі гербіцид "Раундап" (хімічна назва - гліфосат).
У Центрі «Біоінженерія» Російської академії наук протягом двох десятиліть ведуться роботи по генетичній інженерії рослин - як для фундаментальних досліджень, так і для сільського господарства. Були створені генетично модифіковані сорти картоплі, стійкі до колорадського жука, сорти буряка, стійкі до гербіцидів і вірусам і ін. Ці культури могли б вирішити ряд завдань сільського господарства, але через досі чинного в Росії законодавчого обмеження вони не вирощуються у відкритому грунті. Само собою, ця заборона більше ніж дивний, адже ввезення ГМ-продукції в країну дозволено.
Другий напрямок являє собою створення їстівних вакцин. В даному випадку отримують генно-модифіковану рослину, що синтезує вакцину. Такий привабливою здається ідея: лежиш під пальмою, їж банан, і жодна тропічна зараза не бере!
Створено трансгенні рослини картоплі і тютюну, що виробляють білок нуклеокапсида вірусу Норфолк, що викликає у людей гострий гастроентерит і стійкого до спиртовим антисептиком. З'явився і трансгенну картоплю, синтезує поліпептид LT-B - субодиницю термолабільного токсину Е.coli, що викликає діарею. Однак, незважаючи на активні дослідження в цій області, комерційних препаратів на сьогоднішній день немає.
Третій напрям пов'язаний з напрацюванням в рослинах певних продуктів, які потім виділяються з рослин і можуть бути використані, наприклад, в якості лікарських препаратів. Біотехнологічними компаніями по всьому світу вже створено велику кількість ГМ-рослин для отримання білків, в тому числі і медичного призначення [14].
Серед компаній, діяльність яких заснована на використанні трансгенних рослин, слід зазначити фірми Рrotalix (Ізраїль), Medicago (Канада), LemnaGene (Франція), Planet Biotechnology (США), ProgyGene (Люксембург), Сhlorogen Inc. (США), SemBioSys Genetics (Канада) і Bayer AG (Німеччина).
З білків медичного призначення у виробників найбільш популярні інсулін, лізоцим, лактоферин, колаген, ліпаза, антитіла, вакцини та ін.
Багато з цих препаратів вже проходять клінічні випробування. А ось трипсин (на знімку праворуч) вже можна купити у компанії Sigma.
При напрацюванні в рослинних клітинах продуктів медичного призначення теж використовують метод агробактеріальної трансформації, що забезпечує транзієнтної експресію генів на високому рівні. Очевидними перевагами цих систем є простота маніпуляцій, швидкість, низька вартість і високий вихід кінцевого продукту. Крім того, в даному випадку може бути синтез складних білків, що складаються з декількох субодиниць. Цей спосіб дозволяє отримувати протягом декількох днів білок у великих кількостях (до декількох грамів білка на кілограм маси рослини). Вихід продукту починається вже через три години (!) Після проникнення агробактерій в клітку і перенесення ДНК, а експресія зберігається до 10 днів. Максимум напрацювання визначається для кожного білка індивідуально, але в середньому це 3-4 діб. Сумарно на отримання білків в рослинах йде 2-3 тижні (рис. 6).
Малюнок 6. Принципова схема експресії генів цільових білків у рослинах.
Весь процес отримання білка займає 2-3 тижні.
У рослинах вже напрацьовуються вакцини від вірусів папіломи людини, гепатиту В [15], грипу, папіломи великої рогатої худоби [16], африканської катаральної лихоманки, герпесу рогатої худоби [17], ящуру [18] та ін.
У Центрі «Біоінженерія» також ведуться роботи по експресії терапевтичних білків в рослинах. Так, в клітинах Nicotiana benthamiana (вид тютюну) були проведені вакцинні препарати проти вірусу грипу [19, 20]. Основою препарату є висококонсерватівний вірусний білок M2, який приєднаний до білка-носія для збільшення імуногенності. Носієм може бути корова білок вірусу гепатиту В або бактеріальний флажеліну. У разі флажеліну вакцинний препарат застосовують інтраназально, що є явною перевагою. А використання висококонсерватівной послідовності білка M2 робить вакцину універсальної, що виключає необхідність виготовлення щороку все нових і нових її варіантів. Ці вакцинні препарати показали хороші результати по імуногенності і протективний в експериментах з лабораторними тваринами; наступним етапом має стати клінічне тестування.
Клінічні випробування вакцинних препаратів займають тривалий час (близько 10 років). Мимоволі виникає питання з вакциною від грипу, так як кожен рік з'являються нові штами, і чи буде пройшла клінічні випробування вакцина актуальною? Тут більше значення має технологія отримання препарату. Новий тип вакцини проходить повний цикл клінічних випробувань, а потім вже за відпрацьованою методикою може бути отримана вакцина з урахуванням циркулюючих штамів вірусу. Так, зараз сезонні профілактичні щеплення від грипу отримують в курячих яйцях, і такі вакцини вже не проходять клінічних випробувань. Як складуться справи з виробництвом в рослинах рекомбінантних вакцин для масового застосування, покаже час.
Підводячи підсумок, можна сказати, що рослини дали можливість отримання життєво важливих білків методами біотехнології. Людина навчилася брати від природи все краще і уникати гіршого. Як Вільям Шекспір в «Ромео і Джульєтті» написав про рослину:
У його кольорах - цілющий аромат,
А в листі і коренях - сильна отрута.
Так і людство навчилося брати цілющий аромат, але не смертельна отрута у рослин. У рослин-біофабрик - велике майбутнє!
Читати статті за темами:
Помилка в тексті?
Виділи її та натисни ctrl + enter