Рис.1.2.1. Ультразвуковий гомогенізатор (а), магнітний гомогенізатор (б)
Після отримання екстракту, що містить досліджуваний фермент, його необхідно чистити. Всі методи розділення сумішей засновані на тому, що компоненти, що розділяються в результаті будь-яких маніпуляцій виявляються в різних ділянках системи і можуть бути механічно відокремлені один від одного. Виділення індивідуальних білків є ступінчастим процесом, тому що на перших етапах очистки фракції містять безліч домішок. На кожному ступені поділу повинна виходити фракція багатша за необхідне речовиною, ніж попередня. Такий процес часто називають фракционированием. На кожній стадії поділу білок знаходиться або в вигляді розчину, або у вигляді осаду.
Безпосередньо перед очищенням ферментів білкові розчини концентрують. Це можна здійснити методами: а) осадження з наступним розчиненням в меншому обсязі; б) адсорбції на іонообміннику з подальшою елюція; в) ультрафільтрації. Після або до концентрування білкових препаратів проводять їх діаліз, в результаті чого з зразка за допомогою напівпроникною мембрани видаляються низькомолекулярні сполуки, які заміщаються буфером. При діалізі молекули розчиненого низькомолекулярного речовини проходять через напівпроникну мембрану, а нездатні диализированном колоїдні частинки залишаються в ній (рис. 1.2.2). Найпростіший диализатор є мішечок з коллодия (напівпроникного матеріалу), в якому знаходиться діалізіруемой рідина. Мішечок занурюють в розчинник. Поступово концентрація діалізірующего речовини в діалізіруемой рідини і розчиннику стають рівними. Змінюючи розчинник, можна домогтися практично повного очищення від небажаних домішок. Швидкість діалізу вкрай низька. Для прискорення діалізу збільшують площу мембрани, підвищують температуру і здійснюють безперервну зміну розчинника. Екстракт, що пройшов діаліз, називаю діалізатом.
Мал. 1.2.2. Найпростіша система для діалізу
На початковому етапі очищення для поділу білків іноді використовують теплову обробку. Вона ефективна, якщо білок відносно стійкий в умовах нагрівання, в той час як супутні білки денатурують. При цьому варіюють рН розчину, тривалість обробки і температуру.
Після проведення перших етапів очищення білки в екстракті відрізняються один від одного розчинність, молекулярною масою, величиною сумарного заряду молекули, відносною стабільністю і т.д. Ці відмінності використовують для подальшого поділу білків.
Класичним методом поділу білків є метод їх поділу на основі різної розчинності. Для осадження необхідно знизити будь-яким способом розчинність білка. В цілому розчинність білків залежить від їх здатності до гідратації. У глобулярних водорозчинних білків високий рівень гідратації забезпечується розташуванням гідрофільних груп на поверхні. Додавання органічних розчинників знижує ступінь гідратації і призводить до осадження білка. Принцип такого методу полягає в тому, що в міру зростання концентрації органічного розчинника знижується здатність води до сольватації заряджених гідрофільних молекул ферменту. Відбувається зниження розчинності білків до рівня, при якому починається їх агрегація і осадження. Важливим параметром, що впливає на осадження, є розмір молекули білка. Чим більше молекула білка, тим нижче концентрація органічного розчинника, що викликає осадження білка.
Осаджують білки також за допомогою солей, наприклад, сульфату амонію. Цей спосіб називають висолюванням. Висолювання при додаванні необхідної кількості солі - ефективний спосіб концентрування. Принцип цього методу заснований на тому, що при підвищенні концентрації солі в розчині відбувається стиснення іонних частинок, що утворюються противоионами білка, що сприяє зближенню їх до критичного відстані, на якому міжмолекулярні сили ван-дер-ваальсова тяжіння переважують кулонівських сили відштовхування противоионов. Це призводить до злипання білкових частинок і їх випадання в осад.
Для виділення білків застосовують також метод ізоелектричного осадження. Заряд білків обумовлена в першу чергу залишками аспаратата і глутамату (негативний заряд) і залишками лізину і аргініну (позитивний заряд). У міру підвищення рН різними способами заряд білків змінюється від позитивних до негативних значень і в ізоелектричної точці виявляється дорівнює нулю, внаслідок чого білок позбавляється своєї іонної атмосфери і його частки злипаються, випадаючи в осад.
Випав осад білка відділяють фільтрацією або центрифугуванням. Частинки обложеного речовини під дією відцентрової сили осідають на дні центрифужних склянок і стискаються в щільний осад. Швидкісні центрифуги (ультрацентрифуги) створюють відцентрове прискорення порядку 100000g, що дозволяє осаджувати великі надмолекулярні агрегати - рибосоми і віруси.
За допомогою методу гельфільтраціі і можна швидко розділити білки відповідно до їх розмірами. Носієм для хроматографії є гель, який складається з поперечно-зшитої тривимірної молекулярної сітки, сформованої у вигляді гранул. Чим більше поперечних зшивок, тим менше розміри отворів. Гель грає роль молекулярного сита. При пропущенні розчину через колонку, наповнену гранулами сефадексе, великі частки, розмір яких перевищує розмір пір сефадексе, будуть рухатися швидко. Дрібні молекули будуть рухатися повільно, оскільки в процесі руху будуть проникати всередину гранул (рис. 1.2.3).