У 1869 році Кохи влаштувалися в німецькому місті Раквице, де Роберт почав лікарську практику на посаді асистента в лікарні для божевільних, і незабаром став відомим і шанованим лікарем. Однак ця робота Коха була перервана - в 1870 році почалася франко-прусська війна.
Незважаючи на сильну короткозорість, Роберт добровільно став лікарем польового госпіталю і тут набув великий досвід у лікуванні інфекційних хвороб, зокрема, холери і черевного тифу. Одночасно він вивчав під мікроскопом водорості і інші найпростіші організми, удосконалюючи свою майстерність в мікрофотографії.
У 1871 році Кох демобілізувався і в наступному році був призначений повітовим санітарним лікарем у Вольштейні (нині Вольштин в Польщі). Дружина подарувала йому на двадцатівосьмілетіе мікроскоп, у якого тепер Роберт проводив впродовж дня. Він втратив будь-який інтерес до приватної практики і став проводити різні досліди, завівши для цієї мети даний натовп мишей.
«Два роки з властивою йому пунктуальністю вивчав він причини гнійного запалення ран, відкрив крихітних мікробів, що викликають смертельне нагноєння; вивчав він цього мікроба на лабораторних тварин, але так досконально, з такою точністю простежив розвиток запального і гнійного процесу, що випущена їм потім брошура на цю тему наробила багато шуму в медичних колах, - пише М.І. Яновська. - Робота ця досі є класичною. У ній сформульовані три знаменитих вимоги, на підставі яких можна встановити зв'язок даного захворювання з певним мікроорганізмом.
Вперше Кох показав, що кожна хвороба ран має певного збудника. Він писав у своїх трьох умовах, що мікроб повинен завжди виявлятися при даної хвороби і бути відсутнім при інших захворюваннях - тільки тоді він може бути визнаний дійсним збудником; що мікроб цей повинен бути отриманий в чистій культурі; що цією культурою в лабораторному експерименті повинна бути викликана дана хвороба у експериментальної тварини ».
Тоді ж вчений ввів в бактеріологічну техніку метод мікрофотографування.
Далі Кох вирішив спробувати щастя і знайти збудник туберкульозу. У той час в Німеччині від туберкульозу помирав кожна сьома людина. Лікарі були безсилі. Туберкульоз взагалі вважався спадковою хворобою, тому й спроб боротьби з ним не робилося. Хворим прописували свіже повітря і гарне харчування. Ось і все лікування.
Вчений почав наполегливий пошук. Він досліджував зрізи тканин, узятих у хворих, які загинули від туберкульозу. Фарбував ці зрізи різними барвниками і годинами розглядав під мікроскопом. І йому вдалося виявити бактерії у вигляді паличок, які при посіві на живильне середовище (сироватку крові тварин) дали бурхливе зростання. А при зараженні цими бактеріями морських свинок викликали у них туберкульоз. Це була сенсація.
Вивчення Кохом туберкульозу було перервано, коли він за завданням німецького уряду в складі наукової експедиції в 1883 році виїхав до Єгипту і Індію з метою спробувати визначити причину захворювання холерою.
Працюючи в Індії, Кох оголосив, що він виділив мікроб, що викликає це захворювання. Відкриття Коха зробили його одним з тих осіб, хто визначає напрямки розвитку охорони здоров'я, і, зокрема, відповідальним за координацію досліджень і практичних заходів у боротьбі з такими інфекційними захворюваннями, як черевний тиф, малярія, чума великої рогатої худоби, сонна хвороба (трипаносомоз) і чума людини.
«Думка, що мікроорганізми повинні складати причину інфекційних хвороб, уже давно висловлювалася одиничними видатними умами, але до перших відкриттів у цій області поставилися було вкрай скептично, - писав Кох. - Важко було на перших порах довести незаперечним чином, що знайдені мікроорганізми дійсно становлять причину хвороби. Справедливість цього положення скоро була цілком доведена для багатьох інфекційних хвороб ... Тут-то і вдалося з'ясувати, що бактерії далеко не випадкові супутники і що вони зустрічаються правильно і виключно при відповідній хвороби. Вже на підставі цього ми маємо право говорити про існуючу причинного зв'язку між хворобою і паразитом як про достовірне факт і можемо тому приписати паразитарне походження цілої низки хвороб. До таких хвороб відносяться: черевний тиф, дифтерія, проказа і азіатська холера.
... Якщо тільки виправдаються надії і якщо вдасться опанувати мікроскопічним, але могутнім ворогом хоча б в одній бактеріальної інфекційної хвороби, то я не сумніваюся, що скоро доб'ємося того ж і для інших хвороб ».
У 1885 році Кох став професором Берлінського університету і директором тільки що створеного Інституту гігієни. А в 1891 році вчений очолив збудований спеціально для нього Інститут інфекційних хвороб.
У 1893 році Кох, розвівши зі своєю першою дружиною, одружився на молодій актрисі Хедвізі Фрайбург.
З середини дев'яностих років вчений багато часу проводить в наукових відрядженнях. У 1896 році Кох з новою дружиною виїхав до Східної Африки, на боротьбу з чумою рогатої худоби. У наступному році він очолює експедицію в Індію для вивчення чуми. У 1899 році вчений став на чолі експедиції з вивчення малярії в Італії, на Яві і в Новій Гвінеї. У 1903 році Кох відправився в Центральну Африку, на епізоотію рогатої худоби. Він знайшов мікроба-збудника, простежив шляхи передачі та назвав хворобу «африканської берегової лихоманкою».
Весь цей час Кох продовжував дослідження туберкульозу, зосередившись на пошуках способів лікування цього захворювання. У 1890 році він оголосив про те, що такий спосіб знайдений. Кох виділив так званий туберкулін (стерильну рідину, що містить речовини, вироблювані бацилою туберкульозу в ході росту), який викликав алергійну реакцію у хворих на туберкульоз. Однак насправді туберкулін не став застосовуватися для лікування туберкульозу, т к. Особливим терапевтичним дією він не володів, а його введення супроводжувалося токсичними реакціями, що стало причиною його найгострішої критики. Протести проти застосування туберкуліну стихли, лише коли виявилося, що туберкулінова проба може використовуватися в діагностиці туберкульозу. Це відкриття, що зіграло велику роль в боротьбі з туберкульозом у корів, з'явилося головною причиною присудження Коху Нобелівської премії.
У 1905 році Кох за «дослідження і відкриття, що стосуються лікування туберкульозу» був удостоєний Нобелівської премії з фізіології і медицині. У нобелівської лекції Кох сказав, що, якщо окинути поглядом шлях, «який пройдений за останні роки в боротьбі з таким широко розповсюдженим захворюванням, як туберкульоз, ми не зможемо не констатувати, що тут були зроблені перші найважливіші кроки».
За рік до отримання премії Кох пішов з поста директора Інституту інфекційних хвороб. Але він не припинив наукову діяльність і в 1906-1907 роках очолив експедицію в Центральну і Східну Африку для боротьби з сонної хворобою. Для лікування цієї хвороби вчений запропонував атоксил.