Клітинна стінка бактерій є їх важливою відмітною ознакою.
З метою більш детального вивчення клітинних структур бактерій мікробіологічні препарати забарвлюють. Можна фарбувати живі бактеріальні форми, однак така забарвлення не дає повної картини будови мікробної клітини. У зв'язку з цим готують фіксовані препарати мікроорганізмів. Фіксація вбиває живі клітини і одночасно закріплює їх на поверхні предметного скла.
Отримання фіксованих забарвлених препаратів включає приготування мазка, висушування, фіксацію і забарвлення.
Приготування мазка. На знежирене спиртом предметне скло поміщають маленьку краплю водопровідної води і переносять у неї петлею невелику кількість досліджуваного матеріалу, як для препарату «роздавлена крапля». Отриману суспензію рівномірно розмазують петлею на площі 1 - 2 см максимально тонким шаром. Мазок повинен бути настільки тонкий, щоб швидко висихав після приготування.
Висушування мазка найкраще робити при кімнатній температурі на повітрі. Добре приготований тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування відбувається повільно, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря високо над полум'ям пальника, тримаючи скло мазком догори. Цю операцію слід проводити обережно, не перегріваючи мазок, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.
Фіксація препарату переслідує кілька цілей: вбити мікроорганізми, тобто зробити безпечним подальше поводження з ними; забезпечити краще прилипання клітин до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до фарбування, так як мертві клітини фарбуються краще, ніж живі. Найпоширенішим способом фіксації є термічна обробка.
Для цього препарат зазвичай тричі проводять через найбільш гарячу частину полум'я пальника, тримаючи предметне скло мазком догори. Не слід перегрівати мазок, так як при цьому відбуваються грубі зміни клітинних структур, а іноді і зовнішнього вигляду клітин, наприклад, їх зморщування. Для дослідження тонкої будови клітини вдаються до фіксації різними хімічними речовинами. Фіксуючу рідину наливають на мазок, або препарат на певний час занурюють в стакан з фіксуючим розчином.
Забарвлення. Клітини мікроорганізмів фарбують головним чином аніліновими барвниками. Розрізняють кислі і основні барвники. До кислим відносяться барвники, у яких фарбувальними властивостями володіє аніон, у основних барвників хромофором є катіон. Прикладами кислих барвників служать еозин. еритрозин, нігрозин, кислий фуксин; всі вони інтенсивно зв'язуються з цитоплазматичними компонентами клітини. Основні барвники - метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристал-віолет, сафранін - інтенсивніше зв'язуються з ядерними компонентами клітини. Висока концентрація ДНК і рибосомальної РНК в клітині бактерії робить її більш чутливою до основних фарбників. У зв'язку з цим в мікробіологічній практиці застосовуються майже виключно основні барвники.
Розрізняють просте і диференціальне фарбування мікроорганізмів. У першому випадку фарбується вся клітина, так що стають добре видно її форма і розміри. Диференціальне фарбування виявляє тільки певні структури клітини і запасні речовини.
Для простого фарбування клітин мікроорганізмів найчастіше користуються фуксином, генціановий фіолетовим, метиленовим синім. Фіксований препарат поміщають на паралельні скляні палички, що лежать над лотком, наносять на нього розчин барвника і витримують в ньому протягом 1 - 3 хв. Стежать за тим, щоб під час фарбування барвник на мазку НЕ підсихали, і в разі потреби додають нову порцію барвника.
Після закінчення забарвлення препарат промивають водою до тих пір, поки що стікає вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують на повітрі або обережно промокають фільтрувальної папером, поміщають на пофарбований мазок краплю иммерсионного масла і переглядають з об'єктивом 100х. Для отримання більш чистих препаратів барвник наносять на мазок, покритий фільтрувальної папером. Метод фарбування в модифікації Синьова дозволяє використовувати замість розчину барвника заздалегідь просочену їм фільтрувальну папір. В правильно пофарбованому і добре промиті препараті поле зору світле і чисте, пофарбовані тільки клітини.
Фіксувати і фарбувати можна також і препарати-«відбитки». Фіксовані, пофарбовані препарати можуть зберігатися тривалий час.
Форму клітин і їх розташування (ланцюжки, розетки, пакети, тетради і т.д.) виявляють, як правило, на препаратах «роздавлена крапля» при світло-польної або фазово-контрастної мікроскопії. Для визначення форми клітин дрібних паличковидних бактерій, таких як Serratia marcescens. готують препарат фіксованих клітин і застосовують просте фарбування. Клітини дрібних бактерій, що мають вирости - простекі (пологи Caulobacter. Labrys. Prosthecomicrobium. Stella і деякі інші), доцільно досліджувати методом фазового контрасту або в темному полі. Природне розташування клітин в колонії мікроорганізмів, а також спор і спороносцев у актиноміцетів і міцеліальних грибів вивчають на препараті «відбиток».
Необхідно пам'ятати, що вік культури, склад середовища та умови культивування суттєво впливають на морфологію і цитологію мікроорганізмів.
Забарвлення по Граму (складне фарбування мікроорганізмів) і її використання для диференціації бактерій з різною будовою клітинної стінки.
Даний складний (використовує більше однієї діючої речовини) метод забарвлення вперше був запропонований в 1884 р. датським вченим Х. Грамом (Ch.Gram) для фарбування тканин, а пізніше набув широкого поширення при фарбуванні прокаріотів і був названий ім'ям його розробника.
Важливе значення методу забарвлення по Граму в мікробіології визначається тим, що результати фарбування бактерій виявляються безпосередньо пов'язаними з особливостями будови їх клітинних стінок. Поясненням цього є виражені відмінності в будові клітинних стінок грампозитивних (за цим методом окрашивающихся в фіолетовий колір) іграмотріцательних (за цим методом окрашивающихся в червоний колір) бактерій. Перші з них мають досить товсті шари з муреина (у еубактерій) або псевдомуреіна (у архей), які утримують утворюється в протопласті комплекс «кристалічний фіолетовий + йод» і перешкоджають його вимивання з клітки при подальшій обробці спиртом.
У свою чергу грамнегативні бактерії не утворюють подібних гетерополісахарідов або містять їх у невеликих кількостях, недостатніх для запобігання екстрагування комплексу барвника з йодом з протопласта при його обробці спиртом. Сказане пояснює, чому незважаючи на уявну простоту методу Грама, саме він набув найбільшого поширення в якості важливого таксономически значимого тесту, з результатами якого добре корелюють багато інших героїв властивості прокаріотів.
Для реалізації даного методу готують спеціальний барвник - карболовий розчин генціановий фіолетового або кристалічного фіолетового: 1 г барвника розтирають у ступці з 2 г кристалічної карболової кислоти до консистенції кашки, додають невеликими порціями 10 мл 96% спирту, остаточно розводять 100 мл дистильованої води, зливають в бутель, відстоюють і через добу фільтрують. Другим важливим компонентом для забарвлення по Граму є розчин Люголя. в 10 мл дистильованої води розчиняють 2 г йодиду калію і 1 г йоду кристалічного, суміш добре закупорюють і залишають на добу, після чого додають 300 мл дистильованої води.
Процедура фарбування по Граму починається з обробки фіксованих бактеріальних клітин барвником кристалічним фіолетовим, за чим слід обробка клітин розчином йоду. Ці два компоненти разом утворюють крупномолекулярний комплекс, нерозчинний у воді і слабо розчинний в спирті. Тому, використовуючи спирт, клітини диференціюють: при промиванні в ньому «грампозитивні» клітини утримують комплекс «кристалічний фіолетовий + йод» і залишаються синіми, а «грамнегативні» знебарвлюються. Для того ж, щоб також зробити їх видимими, зразки додатково фарбують будь-яким контрастним червоним барвником - зазвичай фуксином.
Серед безлічі запропонованих в даний час варіантів, фарбування по Граму (по Г.П. Калині, по Еткінсу і ін.) Досить широкого поширення набула модіфікаціяпо А.І. Синяву. для реалізації якої попередньо готують смужки фільтрувального паперу, просоченої розчином кристалічного фіолетового і висушеної.
Процедура складного фарбування мікроорганізмів:
1) на предметному склі готують мазок бактеріальної культури, який фіксують над полум'ям пальника;
2) на мазок кладуть шматочок фільтрувального паперу, просоченої розчином кристалічного фіолетового, на який наносять 2-3 краплі води і витримують протягом 2 хв;
3) знімають фільтрувальний папір;
4) не змиваючи водою (!) На препарат наносять 2-3 краплі розчину Люголя і витримують протягом 1 хв;
5) зливають розчин Люголя;
6) опускають предметне скло в стаканчик з 95% спиртом, де ретельно прополіскують препарат протягом 0,5-1 хв, поки не перестане відходити барвник;
7) ретельно промивають препарат водою;
8) наносять на предметне скло розчин водного фуксину і фарбують препарат протягом 0,5-1 хвилин;
9) барвник зливають, ретельно промивають препарат водою, висушують на повітрі і проводять мікроскопію.
Вважається, що в більшості випадків інтерпретація результатів забарвлення мазка за Грамом не представляє труднощів, проте деякі грампозитивні мікроорганізми, зокрема представники роду Bacillus. можуть мати грамотрицательную забарвлення. Навпаки, деякі штами грамнегативних пологів Acinetobacter і Moraxella виявляють тенденції не знебарвлюватися спиртом, тому виглядають грампозитивними.
Для уточнення таких «грам-сумнівних» реакцій запропоновані особливі методи. В Японії запропонували метод «тяжа», що дозволяє відрізнити за допомогою КОН-тесту грамнегативнімікроорганізми від грампозитивних. В основі методу з КОН лежить здатність клітинної стінки грампозитивних бактерій зберігати цілісність при впливі гідроксиду калію, тоді як клітинна стінка грамнегативних мікроорганізмів руйнується при зазначеному впливі.
На предметне скло наносять краплю 3% -ного водного розчину КОН. Петлею вносять добову агарове культуру досліджуваних бактерій і ретельно емульгують. При позитивній реакції, якщо суспензія в краплі стає в'язкою, нитки слизу тягнуться за петлею на 0,5 - 2,0 см і навіть далі, це - грамнегативнібактерії, якщо немає - грампозитивні бактерії. Облік цієї проби більш зручний на чорному тлі.
Освіта слизової консистенції після обробки грамнегативнихбактерій КОН обумовлено виходом з їх клітин ДНК, що є в'язким компонентом.