клітинний термометр
Кандидат біологічних наук Тетяна Перевязова, Кирило Стасевич
Питання, як виміряти температуру всередині однієї-єдиної живої клітини, може здатися дивним.
Важко уявити якусь більш звичну фізичну величину, ніж температура. Слухаємо ми прогноз погоди, відкриваємо водопровідний кран, ставимо собі градусник - ми всюди маємо справу з нею. Температура асоціюється з великими об'єктами - з повітряними масами, з каструлею води, з людським тілом. І питання, як виміряти температуру всередині однієї-єдиної живої клітини, може здатися дивним. Дійсно, як? Та й чи потрібно?
Відповіді на ці питання дають експерименти, проведені в Інституті теоретичної та експериментальної біофізики РАН разом з японськими колегами. Розповідь про ці експерименти і їх результати почнемо трохи здалеку.
Перетворення енергії, будь то в хімічній реакції або в якомусь фізичному процесі, супроводжуються виділенням тепла. У живій клітині таких реакцій і процесів відбувається безліч. Ось один із прикладів: на клітинних мембранах зазвичай формується так званий іонний градієнт концентрації, коли якихось іонів (наприклад, Ca 2+) по одну сторону мембрани дуже багато, а по іншу - дуже мало. Коли приходить пора подати сигнал внутрішньоклітинним біомолекул або ж щось повідомити назовні, іншим клітинам, в мембрані відкривається канал, через який іони потоком рухаються звідти, де їх багато, туди, де їх мало; і саме таке іонну рух виконує потрібну біохімічну і біофізичну роботу. Накопичення світовим співтовариством іонного градієнта і його розрядка за фізико-хімічними законами повинні супроводжуватися підвищенням температури, тобто мембрани і мембранні молекули, які обслуговують іонну кухню, працюють як миттєві джерела тепла. Чи можна це тепло виміряти?
Ми знаємо, що температура - термодинамічна характеристика, вона описує стан великого числа частинок. Грубо кажучи, якщо частинок багато і вони рухаються швидко, а значить, мають високу енергією, то вся система буде гарячою. Якщо рухаються повільно - холодної. Що стосується клітини, то може здатися, що частинок там занадто мало, щоб ми могли виміряти їх температуру.
Насправді все не так. Якщо ми візьмемо, наприклад, один кубічний мікрометр води (обсяг, майже невиразні оком), то зможемо нарахувати в ньому близько 30 млрд молекул. Це величезне число, і у системи з 30 млрд частинок звичайно ж є своя температура. Фізична теорія давно дозволяє описувати мікросистеми за допомогою температурного параметра; велику роль тут зіграли роботи основоположника нерівноважноїтермодинаміки, видатного вченого Іллі Пригожина - бельгійського фізика і фізико-хіміка російського походження, лауреата Нобелівської премії з хімії 1977 року. Але чому ж у такому разі до недавнього часу ніхто не робив цілеспрямованих спроб виміряти локальні внутрішньоклітинні температурні ефекти?
Коли ми маємо справу з великим об'єктом, наприклад з чайником окропу, то вода в ньому остигає повільно. Тепло, накопичене водою, не може швидко піти в повітря, тому що вода і повітря по-різному проводять тепло. Для опису того, що відбувається з температурою в таких системах, існує спеціальний фізико-математичний апарат на основі рівноважної термодинаміки. Але киплячий чайник і повітря на кухні - це «великі» системи. А якщо у нас все мікролітр води або того менше - жива клітина? Ми тільки що сказали, що з молекулярної точки зору мікролітр води - система з величезним числом частинок, що володіє власною температурою. Однак є важливий нюанс: уявімо, що в якомусь місці всередині клітини сталася реакція, що супроводжується виділенням тепла. Нагріється чи хоч на скільки-небудь довкілля, чи відчують її частки прийшло до них тепло? Чи з'явиться в клітці так званий температурний градієнт, коли поруч знаходяться дві області з різною кількістю тепла і тепло з однієї перетікає в іншу так, що ми можемо це виміряти? Колишні розрахунки говорили про те, що потужність джерел тепла в живій клітині занадто мала, щоб створити в ній місцеві градієнти температур. Тобто локальні температурні скачки відбуватимуться, але не настільки великі, щоб вплинути на внутрішньоклітинні процеси.
В останні два-три десятиліття стало ясно, що такі термодинамічні розрахунки, мабуть, не застосовні для мікросистем. Наприклад, електронні пристрої можуть нагріватися досить сильно, і, коли почали досліджувати, як саме нагріваються комп'ютерні процесори, виявилося, що в їх напівпровідникових мікро-і наноструктурах температурні градієнти виходять значно вище, ніж можна було очікувати. Чому так відбувається? Тому що раніше не враховували складну мікроструктурірованность середовища тих самих напівпровідників. Це в чайнику все порівняно просто: навіть якщо ми кип'ятимо складний з хімічної точки зору розчин солей, він все одно однорідний, і можна сказати, що тепло поширюється по всьому об'єму більш-менш рівномірно. А якщо ми маємо справу зі сложноорганизованной структурою, то тепло в різних ділянках її поширюватися буде по-різному. Як приклад того, наскільки структура речовини може впливати на теплопровідність, можна привести вуглецеві нанотрубки: уздовж їх осі теплопровідність складає 1750 ... 5800 Вт / (м · K), а ось якщо пустити тепло перпендикулярно осі, теплопровідність виявиться всього близько 0,02 ... 0,07 Вт / (м · K), тобто на п'ять порядків нижче!
Якщо ми заглянемо всередину живої клітини, то виявимо в ній зовсім не гомогенний розчин білків, ліпідів та ін. - ми побачимо безліч органел, внутрішньоклітинних мембран, великих молекулярних комплексів. Порівняння комп'ютерних процесорів з клітинами здасться тим більш логічним, якщо ми зіставимо їх електродинамічні характеристики. Відомо, що різниця електричних потенціалів на плазматичній мембрані (обумовлена розподілом іонів по обидві її сторони) становить приблизно 100 мВ. З поправкою на різницю в товщині це приблизно та ж напруженість поля, яка існує в наноструктурах мікропроцесорів, а адже в процесорах таке поле призводить до значних теплових ефектів. Якщо десь поруч з ліпідної мембраною трапиться викид тепла, то, як і в процесорі, воно тут затримається на деякий час, тому що сама мембрана і молекулярні комплекси, плаваючі поряд з тепловим вогнищем, будуть відводити тепло не так швидко, як це відбувалося б в однорідному розчині.
Виходить, що клітина через свою складну внутрішню структури повинна бути буквально нашпигована локальними тепловими вогнищами, то виникають, то згасаючими. тут стóит згадати, що хімічні і фізичні реакції не тільки самі виділяють тепло, а й залежать від оточуючих температурних умов: наприклад, є процеси, які при високих градусах йдуть швидше, а є й інші, які, навпаки, при нагріванні сповільнюються. Очевидно, температурні перепади між різними частинами клітини або між самою клітиною і її найближчим оточенням повинні сильно впливати на клітинну фізіологію. Щоб перевірити, чи так воно насправді, треба вміти не тільки вимірювати температуру всередині однієї-єдиної клітини, але і нагрівати її, щоб подивитися, як вона відреагує - якщо взагалі відреагує.
Саме це вдалося зробити кандидату фізико-математичних наук Вадиму Цееб і його колегам з Інституту теоретичної та експериментальної біофізики (ІТЕБ) Російської академії наук разом з співробітниками японського Університету Васеда. Їх нанонагреватель робиться порівняно просто. Береться суспензія наночастинок алюмінію, діаметр яких становить близько 100 нм. У суспензію на пару секунд опускають кінчик (діаметром близько мікрометра) звичайних скляних микропипетки. Водна суспензія потрапляє в кінчик піпетки, який потім підносять до нагрівача: вода випаровується, а наночастинки залишаються. Потім кінчик піпетки підводять ще ближче до нагрівача, щоб він оплавився - в результаті всередині микропипетки виявляються запаяними кілька наночасток алюмінію. Взагалі, як «наповнювача» для нанонагревателя можуть виступати й інші метали - платина, срібло, золото. Вибір алюмінію був пов'язаний лише з тим, що його наночастинки слабо злипаються один з одним.
Саме метал буде гріти клітку, а щоб розігріти самі наночастинки, потрібен інфрачервоний лазер з довжиною хвилі 1064 нм - його випромінювання не поглинають ні вода, ні скло, тому вся енергія випромінювання піде в алюміній. Утримуючи лазерний промінь на кінчику нанонагревателя, можна буквально за мілісекунди отримати крутий температурний градієнт - через малу теплопровідності води все тепло буде виділятися в наночастицах.
Але це нагрівач, а що термометр? Він влаштований схожим чином і являє собою запаяну микропипетку з термочутливим флуоресцентним речовиною: в залежності від температури речовина флуоресціює на різних частотах. Коли ми підносимо кінчик термометра до кінчика нагрівача, молекули в кінчику термометра відчувають тепло і починають світитися інакше. Природно, нагрівач і термометр випробували спочатку без клітин, в чистій воді, і вже в таких попередніх експериментах вдалося отримати цікавий результат. Коли наночастинки розігрівали до 100 о С, на нагрівачі з'являвся бульбашка насиченої пари - простіше кажучи, вода поруч з ним скипала. Але вже на відстані всього 20 мкм температура падала до 30 о С, після чого повільно знижувалася до 24 о С. (Для порівняння: розмір мітохондрій, найважливіших органел клітини, які добувають для неї енергію і в яких протікає величезна кількість реакцій, становить від 0 , 5 до 10 мкм.) якраз в таких випадках і говорять, що має місце крутий температурний градієнт: оскільки вода погано проводить тепло, то вже в найближчих околицях нанонагревателя температура виявляється на цілих 70 о С нижче. І навіть якщо лазер буде весь час підтримувати на наночастицах температуру 100 о С, температурний градієнт нікуди не дінеться.
Чому ми так багато говоримо про температурний градієнт? Уявімо, що нанонагреватель зі 100 о С на кінчику наблизився до клітки. Їй, звичайно, від цього буде непереливки. Але її сусідки нічого серйозного не відчують, в гіршому випадку - потепління на кілька градусів: градієнт-то крутий, температура в міру віддалення від нагрівача дуже швидко падає. А тепер уявімо, що вбита клітка була ракової, а її сусідки - звичайними, здоровими. Якби у нас в руках опинився такий температурний скальпель, можна було б виключно точно ліквідувати осередки злоякісних пухлин, анітрохи не шкодячи оточуючим здоровим тканинам. (Особливо з огляду на те, що пухлини гірше переносять термічний стрес.)
Але перш ніж фантазувати з приводу застосування нового методу, добре б дізнатися, чим продовжилися досліди з нанонагревателем. Установку випробували з людськими клітинами, в яких створювали градієнт температур, а самим клітинам давали барвник, чутливий до змісту іонів кальцію. Як ми пам'ятаємо, різні іони, в тому числі і кальцієві, розподілені по клітці нерівномірно: спеціальні білки перекачують їх в ті чи інші органели або в цитоплазму, і якщо говорити про кальцій, то він накопичується в складній системі мембранних бульбашок і трубочок, яка називається ендоплазматичної мережею або ендоплазматичним ретикулумом. Виявилося, що нагрівання і наступне охолодження стимулюють потужний викид іонів кальцію з ендоплазматичної мережі в цитоплазму, що було видно по фарбуванню чутливого до кальцію барвника, який теж плавав по цитоплазмі.
Це може здатися простим досвідом, і незрозуміло, навіщо потрібно було створювати нанонагреватель: чому б просто не нагрівати клітини в живильному середовищі, одночасно дивлячись на них в мікроскоп? Але, по-перше, при загальному нагріванні клітини просто спливали б з фокуса мікроскопа через теплового розширення матеріалів. А по-друге, викид кальцію відбувався при дуже-дуже швидкому охолодженні: після виключення лазера градієнт температур зникав буквально за мілісекунди. Такий надшвидкий теплової стрибок неможливо було б влаштувати, просто нагріваючи клітинну культуру.
Не варто довго пояснювати, що за перспективи відкриваються для біології. По-перше, відомо, яку величезну роль для клітини грають трансмембранні іонні потенціали; можна згадати і про мітохондрії, які за допомогою потоку іонів через спеціальний мембранний фермент синтезують для клітини енергетичні молекули, і про нейрони, які генерують нервовий імпульс саме завдяки нерівномірного розподілу іонів по обидві сторони клітинної мембрани. Діючи на клітку тепловими імпульсами, ми можемо більше дізнатися про самих фундаментальних процесах в її фізіології. По-друге, якщо тепло настільки сильно впливає на клітинний ріст, то легко уявити, як такий нанонагреватель можна використовувати в регенеративної медицини, де часто буває потрібно відновити пошкоджені відростки у нервових клітин або взагалі змусити клітини рости в певну сторону. Крім того, температурний градієнт можна використовувати в іншому високотехнологічному методі - методі 3D-друку, де зараз активно освоюють друк живими клітинами.
Звичайно, ми зараз вже дуже багато знаємо про те, як температура впливає на клітку. Але до сих пір досліджували переважно або окремі фізико-хімічні реакції, або цілі клітинні культури. Останнім часом в біології активно розвиваються методи, які дозволяють досліджувати поведінку окремо взятих клітин і окремо взятих молекул, так що в цьому сенсі описані експерименти знаходяться на самому передньому краї біологічної науки. А оскільки багато теплові ефекти відбуваються в клітині дуже швидко, то за допомогою нового методу ми якраз в змозі побачити, що відбувається при миттєвому розігріванні і миттєвому охолодженні дуже невеликого обсягу цитоплазми клітини або навколишнього її середовища.