Один з найважливіших етапів програми ЕКО - ембріологічний. Саме від того, як буде виконано оцінку якості і запліднення яйцеклітини, а також подальше культивування до дозрівання ембріонів залежить успішний результат екстракорпорального запліднення.
Успіх визначається досвідом конкретного ембріолога, і контролю цей етап не піддається. Але при цьому багатьом жінкам буде дуже корисно дізнатися, як здійснюється запліднення яйцеклітини і культивування до стадії ембріонів.
Клініки для лікування безплідності застосовують для цієї мети різні середовища, і залежить це, крім іншого, від бюджету і технологічної оснащеності.
культуральне середовище
Вимоги, що пред'являються до культурному середовищі, використовуваної при ЕКЗ, вельми серйозні: її показники повинні максимально збігатися з параметрами, якими володіє природна рідина, що служить середовищем для ембріонів і яйцеклітин в жіночому організмі.
Основні характеристики, якими повинна володіти середовище:
- рівень РН - 7,4. Точно таким же рівнем РН має кров людини. Визначити РН можна за допомогою кольорового індикатора, який повинен змінити колір в червоно-оранжевий колір;
- осмолярність, що дорівнює 285 мОсм / кг води. Вона також відповідає осмолярності, якою володіє кров;
- вода, яка використовується для приготування живильного середовища, повинна пройти подвійну дистиляцію. Ідеальний варіант, який практикують багато центрів з лікування безпліддя - придбання води у відомих виробників, які гарантують високу якість своєї продукції, наприклад, у компаній Ampuwa, Sigma;
Зазвичай в якості джерела білка при ЕКЗ використовують людський або бичачий сироватковий альбумін, або інактивовану сироватку людини. У середу іноді додають амінокислоти, оскільки вони є в яйцеводах представників деяких сімейств ссавців. Але стабільність за умов культивування виявляють далеко не всі амінокислоти. Як тільки температура середовища досягне 37 градусів, вони розпадаються, виділяючи при цьому токсичні елементи.
Крім того, поживні середовища, які використовуються при екстракорпоральному заплідненні, можуть включати нуклеотиди, вітаміни і мікроелементи.
СО2 культиватор
Для культивування яйцеклітин і ембріонів при ЕКЗ необхідна наявність в повітрі 5% СО2, вологість не менше 80% і не більше 90%, а також температура 37 градусів. Найбільш оптимального співвідношення цих показників можна досягти, застосовуючи СО2 інкубаторів, в яких автоматично підтримуються необхідні показники. Вуглекислий газ подається зі спеціального балона і з навколишнього повітря, необхідна вологість досягається за допомогою випаровування води.
Оцінка якості ооцитів
На той момент, коли в процесі ЕКО здійснюється пункція фолікулів, разом з ними нерідко захоплюються і ооцит-cumulus, іноді і з частинками фолікулярного епітелію. Оскільки в фолікулярної рідини міститься фібриноген, це може сприяти формуванню згустків, що ускладнюють виявлення яйцеклітини. Щоб спростити процес, ооцити, отримані в результаті пункції, промивають, або поміщають фолікулярну рідину в контейнер з антикоагулянтом (гепарином).
Фолікулярну рідину перевіряють на наявність згустків яйцеклітин-cumulus, потім переливають її в чашку Петрі і перевіряють ще раз, але вже під мікроскопом. Як правило, яйцеклітини можна розгледіти неозброєним оком, виглядають вони як слизові згустки розміром 5-10 мм.
Виявлені ооцити відмивають в спеціальному середовищі, а потім перекладають в спеціальну чашку, де буде здійснюватися запліднення яйцеклітини. Для цього використовуються пастерівські піпетки з маленькою гумовою грушею на кінці або ж капіляри зі скла або пластику, які під'єднують до мікроаспіратору. Вибір інструментарію залежить від самого ембріолога, що здійснює штучне запліднення яйцеклітини.
Після того, як ооцити поміщені в культуральне середовище, фахівець попередньо оцінює їх якість, кількість і ступінь зрілості. Причому комплекси ооцитів - cumulus не завжди дозволяють дати справжню оцінку яйцеклітини.
У циклах екстракорпорального запліднення часто відзначаються відсутність синхронності при дозріванні ядер ооплазми, самої яйцеклітини і клітин cumulus.
Показники абсолютно зрілої яйцеклітини такі: діаметр - 110-120 мкм, ооцит повинен бути оточений блискучою плівкою (zona pellucida), кількома клітинами променистого вінця (corona radiata) і безліччю клітин яйценосного горбка (cumulus oophorus).
У пунктіровать яйцеклітині має бути закінчено перший розподіл мейозу, після яких перший полярне тільце відокремлюється. Друге поділ, як правило, знаходиться в стадії метафази. Хромосоми утворюють ряд, створюючи тим самим метафазну пластинку, що розташовується прямо над полярним тільцем. При цьому в яйцеклітині здійснюється блок мейозу, зняти який здатний лише сперматозоїд, що проник крізь оболонку.
Обробка сперми перед ЕКО
У зрілого сперматозоїда є грушоподібної головка, злегка сплощення, розміри її досягають в довжину приблизно 6 мкм, а в ширину, в районі екваторіального сегмента - 4 мкм. Складається головка з ядра і акросоми, яка включає в себе литические ферменти. Вона нагадує шапочку і розташовується над верхньою частиною головки. Розмір хвоста сперматозоїда досягає в довжину приблизно 50 мкм. Хвіст бере свій початок від головки, приблизно в області шиї, там же знаходиться комплекс мітохондрій і центриоль.
запліднення яйцеклітини
Сперматозоїду, перед тим, як проникнути в ооцит, наслідком чого стає запліднення яйцеклітини, належить подолати ряд перешкод:
1) cumulus. Проникаючи всередину нього глибше, сперматозоїд збільшує свою швидкість, демонструючи фазу гіперактивності.
2) zona pellucida. Тут сперматозоїд зв'язується з рецептором.
Після цього здійснюється акросомная реакція, при якій цитоплазматическая мембрана і мембрана акросоми об'єднуються. Вміст акросоми потім викидається, зв'язується з zona pellucida, потім сперматозоїд проникає через оболонку яйцеклітини, не втрачаючи своєї активності.
На тому місці, яке розташовується між оболонкою яйцеклітини і zona pellucida, сперматозоїд приєднується своїми рецепторами до рецепторів, які розташовуються на оболонці яйцеклітини. Це сприяє виникненню кортикальной реакції, яка стає причиною незворотних процесів zona pellucida, що робить її недоступною для проникнення інших сперматозоїдів. Через кілька годин, обидві гамети об'єднують свій генетичний матеріал, після чого утворюється зигота. Хромосоми починають готуватися до процесу першого поділу дроблення.
Через добу, ооцити поміщають в лунку, наповнену свіжою культуральної середовищем, визначаючи, чи відбулося запліднення яйцеклітини.
Після того, як туди будуть додані сперматозоїди, з'являться пронуклеуси (це відбувається через 10-16 годин). Ще через 6-8 годин вони безслідно зникнуть. Важливо вчасно помітити їх, оскільки саме їх поява говорить про те, що запліднення яйцеклітини відбулося. У разі, якщо спостерігається один пронуклеус, або ж більше двох, то це говорить про розвиток в процесі ЕКО аномального запліднення яйцеклітини.