основи біохімії
підтримувати стандартні умови для прояву активності ферменту: температура 25 ° С, оптимальне значення рН і, що особливо істотно, повне насичення ферменту субстратом. Швидкість ферментативної реакції, яка вимірюється при дотриманні перерахованих умов, позначають V і називають максимальною швидкістю ферментативної реакції. Вона визначається концентрацією ферменту і константою швидкості розпаду комплексу фермент-продукт: V = k + 2 \ f] -
Швидкість ферментативної реакції, що спостерігається при відсутності повного насичення ферменту субстратом, позначають v. Вона в кожен даний момент пропорційна концентрації фермент-субстратного комплексу: v = k + 2 [ES
\. Так як [? S] = = * Л + 1 [5], a k + 1lk-l = l / K "т. Е.
Таким чином, спостерігається швидкість ферментативної реакції залежить від концентрації ферменту і субстрату і їх спорідненості. Чисельно Кт дорівнює тій концентрації субстрату (в молях на літр), при якій v становить 1 / 2К (рис. 48). про, 1 о, 2 аз ofi Концентрацію ферменту і субстрату
Концентрація субстрату [Sh толь висловлюють зазвичай в мікромолі на літр.
Однак з огляду на те, що точна молекулярна маса більшості ферментів і число каталітичних (активних) центрів в їх молекулах невідомі, застосовують умовний спосіб вираження абсолютної кількості ферменту. За одиницю лю-
Мал. 48. Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату при постійній концентрації ферменту
Після досягнення стану насичення ферменту субстратом швидкість ферментативної реакції досягає максимального значення V і крива йде паралельно оса абсцис
бого ферменту (позначається на рос. і німий. Е, а на англ. франц. італ. і ісп. U) приймають то його кількість, яке в стандартних умовах каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв. Ця величина (1 мкмоль / хв) є також одиницею активності ферменту. Зазначена стандартна система позначення кількості ферменту була введена в 1961 р Комісією по ферментам Міжнародного біохімічного союзу і міцно увійшла в ферментології. Нею користуються і понині. Як зазначено вище, згідно з цією системою швидкість ферментативної реакції висловлювали числом мікромолей субстрату, що перетворюються в 1 хв.
У 1972 р в зв'язку з переходом на вираз швидкості биокаталитических перетворень в молях субстрату, що перетворюється в протягом 1 с, було запропоновано замість старої, безіменній одиниці ферментативної активності (Е або U) ввести нову одиницю-катав (символ-кат), що позначає кількість ферменту, здатне протягом 1 з забезпечити перетворення 1 моля субстрату (в стандартних умовах). Так як одиниця ферментативної активності в 1 кат, відповідна швидкості реакції 1 моль / с, мало реальна (перетворення йдуть з набагато меншою швидкістю), каталітичну активність в новій системі одиниць висловлюють в мікрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) і пікокаталах (пкат) , чому відповідають швидкості реакцій в мікромолі, нано-молях і пікомоль в секунду відповідно. Стара одиниця (Е або U) дорівнює 16,67 нкат. Протягом найближчих років мають намір провести перехід на вираз ферментативної активності в катали.
Якщо відомо, скільки активних центрів знаходиться в молекулі ферменту, активність його характеризують числом молекул субстрату, перетворених за допомогою одного активного центру. Так, молекулярна активність каталази дорівнює 5 млн. Тоді як активність її каталітичного центру (їх в молекулі каталази 4) складає всього 1 млн. 250 тис. Молекул Н202.
Будучи білками, ферменти мають усіма їх властивостями. Разом з тим біокаталізатори характеризуються рядом специфічних якостей, теж випливають з їх білкової природи. Ці якості відрізняють ферменти від каталізаторів звичайного типу. Сюди відносяться термолабильность ферментів, залежність їх дії від значення рН середовища, специфічність і, нарешті, схильність впливу активаторів і інгібіторів.
Термолабильность ферментів пояснюється тим, що температура, з одного боку, впливає на білкову частина ферменту, наводячи при занадто високих значеннях до денатурації білка і зниження каталітичної функції,
Мал. 49. Вплив температури на Рис. 50. Вплив рН середовища на ак-
активність ферменту (пояснення тивность ферменту
а з іншого боку, впливає на швидкість реакції освіти фермент-субстратного комплексу і на всі наступні етапи перетворення субстрату, що веде до посилення каталізу.
Залежність каталітичної активності ферменту від температури виражається типовою кривою (рис. 49). За характером кривої видно, що до деякого значення температури (в середньому до 50 ° С) каталітична активність зростає, причому на кожні 10 ° С приблизно в 2 рази підвищується швидкість перетворення субстрату. У той же час поступово зростає кількість інактивованої ферменту за рахунок денатурації його білкової частини. При температурі вище 50 ° С денатурація ферментного білка різко посилюється і, хоча швидкість реакцій перетворення субстрату продовжує зростати, активність ферменту, що виражається кількістю перетвореного субстрату, падає.
Детальні дослідження зростання активності ферментів з підвищенням температури, проведені останнім часом, показали більш складний характер цієї залежності, ніж вказано вище: у багатьох випадках вона не відповідає правилу подвоєння активності на кожні 10 ° С в основному через поступово наростаючих конформаційних змін в молекулі ферменту.
Температура, при якій каталітична активність ферменту максимальна, називається його температурним оптимумом.
Температурний оптимум для різних ферментів неоднаковий. Загалом для ферментів тваринного походження він лежить між 40 і 50 ° С, а рослинного-між 50 і 60 ° С. Проте є ферменти з більш високим температурним оптимумом, наприклад у папаина (фермент рослинного походження, що прискорює гідроліз білка) оптимум знаходиться при 80 ° С. У той же час у каталази (фермент, що прискорює розпад Н202 до Н20 і 02) оптимальна температура дії знаходиться між 0 і 10 ° С, а при більш високих температурах відбувається енергійне окислення ферменту і його інактивація.
Залежність активності ферменту від значення рН середовища була встановлена понад 50 років тому. Для кожного ферменту існує оптимальне значення рН середовища, при якому він проявляє максимальну активність. Більшість ферментів має максимальну активність в зоні рН поблизу від нейтральної точки. У різко кислої або різко лужному середовищі добре працюють лише деякі ферменти (табл. 10).
Оптимальні значення рН середовища для деяких ферментів
Характер каталізуються реакції
Ліпаза (з насіння рицини)
Гідроліз білка гідроліз жирів »сечовини» білка »аргініну
Перехід до більшої або меншої (в порівнянні з оптимальною) концентрації водневих іонів супроводжується більш-менш рівномірним падінням активності ферменту. На рис. 50 представлена крива, що виражає типову залежність каталітичної дії ферменту від рН середовища.
Вплив концентрації водневих іонів на каталітичну активність ферментів полягає у впливі її на активний центр. При різних значеннях рН в реакційної середовищі активний центр може бути слабкіше або сильніше іонізований, більше або менше екранований сусідніми з ним фрагментами поліпептидного ланцюга білкової частини ферменту і т. П. Крім того, рН середовища впливає на ступінь іонізації субстрату, фермент-субстратного комплексу і продуктів реакції, дуже впливає на стан ферменту, визначаючи співвідношення в ньому катіонних і аніонних центрів, що позначається на третинної структурі білкової молекули. Остання обставина заслуговує на особливу увагу, так як певна третинна структура білка-ферменту необхідна длЯ освіти фермент-субстратного комплексу.
Специфічність-одне з найбільш видатних якостей ферментів. Це властивість їх було відкрито ще в минулому столітті, коли було зроблено спостереження, що дуже близькі за структурою речовини-просторові ізомери (а- і Р-метілглюкозіди) розщеплюються по ефірного зв'язку двома абсолютно різними ферментами:
Таким чином, ферменти можуть розрізняти хімічні сполуки, що відрізняються один від одного дуже незначними деталями будови, такими, наприклад, як просторове розташування метоксільних радикала і атома водню при 1-м вуглецевому атомі молекули метілглюкозіда.
За образним висловом, нерідко вживається в біохімічної літературі, фермент підходить до субстрату, як ключ до замка. Це знамените правило було сформульовано Е. Фішером в 1894 р виходячи з того, що специфічність дії ферменту зумовлюється суворим відповідністю геометричній структури субстрату і активного центру ферменту.
У 50-ті роки ХХ століття це зріз було замінено гіпотезою Д. Кошланда про індукований відповідно субстрату і ферменту.
а-Метілглюкозід (гідролізується по ефірного зв'язку ферментом з солоду)
У метил ЛГЛ ю козід (гідролізується по ефірного зв'язку ферментом з насіння
Суть її зводиться до того, що просторове відповідність структури субстрату і активного центру ферменту створюється в момент їх взаємодії один з одним, що може бути виражено формулою «рукавичка-рука». При цьому в субстраті вже деформуються деякі валентні зв'язки і він, таким чином, готується до подальшого каталітичного видозміни, а в молекулі ферменту відбуваються конформаційні перебудови. Гіпотеза Кошланда, заснована на допущенні гнучкості активного центру ферменту, задовільно пояснювала активацію та інтібірованіе дії ферментів і регуляцію їхньої активності при впливі різних факторів. Зокрема, конформаційні перебудови в ферменті в процесі зміни його активності Д. Кошланд порівнював з коливаннями павутини, коли в неї потрапила видобуток (субстрат), підкреслюючи цим крайню лабільність структури ферменту в процесі каталітичного акта.
В даний час гіпотеза Кошланда поступово витісняється гіпотезою топохимической відповідності. Зберігаючи основні положення гіпотези взаємо-індукованої настройки субстрату і ферменту, вона фіксує увагу на тому, що специфічність дії ферментів пояснюється в першу чергу впізнавання тієї частини субстрату, яка не змінюється при каталізі. Між цією частиною субстрату і субстратним центром ферменту виникають численні точкові гідрофобні взаємодії і водневі зв'язку.
Безсумнівно, що специфічність ферментів пояснюється в першу чергу збігом просторових конфігурацій субстрату і субстратного центру ферменту. Мабуть, тільки тоді, коли збіг це досить повно, може утворитися фермент-субстратної комплекс і, отже, початися процес ферментативного каталізу. З'ясування третинної структури деяких білків-ферментів повністю виправдало таку точку зору. Так, в молекулі лізоциму (фермент, що прискорює гідроліз глікозидних зв'язків у полисахаридах клітинної стінки бактерій) виявлена виїмка (щілину) (див. Рис. 34) для приєднання субстрату. У цю виїмку щільно входить ділянку молекули субстрату протяжністю рівно о шостій ланок:
Залишок Залишок N-ацетил-N-ацетил-глюкоиміна мураміновой кислоти
Інша частина молекули субстрату, що складається з декількох сотень залишків аминосахаров або їх похідних, залишається вільною. Не тільки загальна форма щілини в молекулі лізоциму відповідає параметрам входить до неї ділянки субстрату, але і розташування окремих амінокислотних радикалів в субстратном центрі цього ферменту абсолютно точно узгоджується з розміщенням певних атомів і атомних груп в молекулі субстрату. Саме за рахунок зазначених радикалів і груп замикаються водневі зв'язку між лізоцимом і полисахаридом в процесі становлення фермент-субстратного комплексу (табл. 11).
Багатоточкове взаємодія фрагмента молекули полісахариду клітинної стінки бактерії з лізоцимом
Буквені позначення полісахарндлих ланок Число зв'язків і слабких взаємодій Енергія асоціації, кДж / моль
водневих Ван-дер-Ваальса Ф. 1 7 7,5-9,6
Одночасно проти радикалів каталітичного центру (залишки глу і асп, що займають в поліпептидного ланцюга лізоциму 35-е і 52-е положення відповідно) встановлюється гликозидная зв'язок, розташована між кільцями D і Е субстрату, і настає каталітичний акт: