РГГА. Основний, високоспецифічний і простий у виконанні метод ідентифікації вірусу НБ. Для постановки необхідно мати еталонні специфічні сироватки до виру-су і виділений на КЕ вірус (аллантоісная рідина) РГГА ставлять загальноприйнятим мето-дом в макро- і мікроваріант. Ідентифікацію вірусу вважають завершеною, якщо ця-лонная специфічна сироватка гальмує ГА-активність вірусу в межах цілого або 1 / 2-1 / 8 титру з гомологічним еталонним АГ. Для швидкої ідентифікації виділеного вірусу рекомендують наступний метод: на предметне скло наносять краплі аллантоісной рідини і 1% -ву суспензію курячих еритроцитів. Потім ставлять пробу на нейтралізацію ГА-активності. Для цього на предмет-ве скло наносять краплю тієї ж аллантоісной рідини, краплю еталонної специфічної сироватки і гарненько перемішують. Якщо аглютинації еритроцитів немає, значить ви-поділений вірус є вірусом НБ.
Приготування гіперімунна сироваток. 5-8-міс курей з титрами анти-ГА поствакц-нального імунітету проти НБ 1: 4-1: 64 гіперіммунізіруют вірус-вакцинами з шт. В1, La Sola, Н. Перше введення роблять з ад'ювантом (автоклавуватися суміш ланоліну з вазеліном у співвідношенні 1: 1,5). На 1 мл суміші додають 5 мл вакцинного вірусу. Суміш розтирають у ступці і поміщають у водяну баню на 30 хв при температурі 56 ° С.
1-й раз вакцину вводять з ад'ювантом в обсязі 1 мл внутрішньом'язово, 2-й раз - через 3 дні без ад'юванта, 3-й раз ще через 3 дні без ад'юванта. Через 10 днів перевіряють актив-ність гіперімунна сироваток Титр їх зазвичай становить 1: 6144-1 12288.
РН на КЕ. Використовують для ідентифікації вірусу рідко, так як вона трудомістка і тривалий-тельна. Реакцію використовують в спірних ситуаціях РН ставлять загальноприйнятим методом зазвичай в варіанті розведення вірусу і постійної дози сироватки. Реакцію вважають по-ложітельной при індексі нейтралізації> 21g.
РСК. У діагностичній практиці при НБ використовують рідко. Запропоновано РСК як би-стрий і дешевий метод диференціації штамів вірусу НБ по вірулентності
РИФ. Метод заснований на застосуванні родамінсульфохлоріда для кон'югації імунної-ної сироватки до вірусу з метою ідентифікації вірусного АГ в уражених клітинах пав-ших і убитих птахів Застосування цього барвника найбільш прийнятно і зручно завдяки яскравому оранжево-червоному світіння АГ. ФИТЦ-кон'югати (флюоресцеінізотіоціанат) менш придатні Для виявлення специфічного АГ застосовують гомологічні РСХ-кон'югати загальноприйнятим методом. У більшості випадків АГ виявляється в ядрах клітин білої крові (лімфоцитах, моноцитах, псевдоеозінофілах і еозинофілів) або уражених клітин зазначених органів у вигляді яскравої флюоресценції оранжево-червоного кольору. У кон-контрольних препаратах, оброблених тими ж гомологічними кон'югатами, подібного све-чення не спостерігається, лише в деяких випадках виявляється точкове жовто-помаранчеве свічення в цитоплазмі юних еозинофілів. Встановлено, що вірусний АГ в заражених культурах клітин (ФЕК і ВНК-21) виявив-ся, починаючи з 4 год (для велогенних штамів) і з 6 ч (для лентогенних штамів), до 10-12год світіння АГ відзначали тільки в цитоплазмі, а через 20 год - в цитоплазмі і ядрах клітин.
РИГА. У ВНІВІП розроблена методика отримання висушених стандартних висо-кочувствітельних і специфічних еритроцитарних тест-препаратів з AT до вірусу НБ для експрес-діагностики. Зазначений еритроцитарний діагностикум дозволяє виявити вірус в екскретів органів і тканин.
ІФА. Методом ІФА вірусний АГ виявляють в ранні терміни після зараження до появ-лення ЦП Д. Через 12 годин після зараження видно поодинокі АГ-містять клітини.
Ідентифікація за допомогою монАТ. Досліджено різні штами вірусу і Дос-ляти НБ на гомологичное спорідненість до монАТ. В результаті тестування 40 ізолятів і штамів з використанням набору з 9 монАТ виявлено 8 груп. Віруси кожної групи мали як загальними АГ-властивостями, але і однаковими епізоотичними рисами монАТ до ГА і глікопротеїну F рекомендовано використовувати для визначення патогенності і біологічної характеристики штамів, що циркулюють в стадах вакцинованих і невакцинованих птахів Вони можуть бути використані для ідентифікації польових з-Лятов, АГ-родинних шт. La Sota і В1, швидкої диференціації цих вакцинних штам-мов від вірулентних польових ізолятів.
Метод картування олігонуклеотидів. Цим методом досліджено біохімічний склад кількох штамів вірусу НБ, виділених в штатах Каліфорнія, Техас і Флорі-да, це дозволило легко диференціювати штами один від одного. Частина штамів оказа-лись ідентичними. Вважають, що метод олігонуклеотидних картування може бути еф-фективно використаний з метою оцінки епізоотичної ситуації.
Визначення вірулентності виділеного вірусу. Крім серологічної иденти-ції часто виникає необхідність визначення вірулентності виділеного ізоляту. Це важливо, коли виникає підозра, що виділений збудник є штамом, що застосовуються для масової вакцинації. Ступінь вірулентності можна визначити наступними методами.
Метод Хенсона - визначення індексу внутрішньомозкової вірулентності. Досліджуваним матеріалом в розведенні 1:10 заражають интрацеребрально в дозі по 0,05 мл 10 1-дн ціп-лять, отриманих від невакцинованих проти НБ курей. Час спостереження 8 дн. Все по-Гибш курчата вважаються специфічними; їх суму множать на коефіцієнт 2. Всі курчата, що проявили клінічні ознаки, теж вважаються специфічними; їх суму множать на коефіцієнт 1. Індекс интрацеребрально патогенності обчислюють шляхом ділення суми балів на 80 (число спостережень за 10 курчатами протягом 8 днів). Для ленто-генних штамів індекс до 0,2, для велогенних штамів - більше 1,5. Недоліком даної методики є - постійний період спостереження - 8 дн.
Метод визначення середнього часу загибелі 10-дн ембріонів, викликаний минималь-ний летальною дозою (СВГ / МЛД). Для цього готують серію 10-кратних розведенні дослі-дуємо вірусу від 10 -1 до 10 -10. п'ять з них (10 -1. 10 -7. 10 8. 10 9. 10 -10 використовують для зара-ження 10-дн КЕ в аллантоісную порожнину в обсязі по 0,1 мл. Кожним з цих розведенні інокуліруют по 10 КЕ: по 5 заражають в 8 годин ранку і -в 16 год (в загальному заражають 50 ембріо-нів) і інкубують їх при 37 ° С. Спостерігають за ними 2 рази в день через 8 ч протягом 120 ч. час загибелі кожного загиблого ембріона реєструють . Мінімальною летальною дозою вважають найбільше розведення вірусу, що викликає загибель всіх інокульованої ембріонів. Середній час загибелі знаходять шляхом ділення суми годин загибелі всіх ембріонів, визв Ганною мінімальної летальною дозою, на число ембріонів: середній час загибелі до 60 год - велогенние штами; середній час загибелі від 61 до 90 год - мезогенних штами; середній час загибелі від 90 і більше 100 ч - лентогенние штами. Однак методи ці дорогі і вимагають багато часу - необхідно затратити щонайменше 7 дн для того, щоб диференціювати дикі штами від вакцинних.
РСК. Швидкий і дешевий спосіб диференціації штамів. Діагноз ставлять протягом 3 днів після отримання проб. Найслабше зв'язування комплементу викликають велогенние дикі штами, найсильніше -лентогенние (наприклад La Sota), в межах між сильні-ми і слабкими - мезогенних. Крім того, вірулентні штами менш антигенів, ніж вакуум-цінние, щодо індукції синтезу КСА у морських свинок. Найбільшу виразну диффе-диференціацію дає сироватка морських свинок, імунізованих штамом Хітчнера.
Біопроба. Починаючи з 1972 р в США, а потім і в інших країнах були виділені штами з дуже високою вірулентністю. Їх називають штамами WND (вісцеро-тропний штами НБ). Для ідентифікації проводиться биопроба на сприйнятливих курчат-тах у віці не менше 6 тижнів. Курчат заражають в клоаку. Кілька особин заражають в око, вносячи туди краплю вірусу. За птахами спостерігають 10 дн. Якщо протягом цього періоду жоден курча не гине, вважають, що штам не відноситься до WND. Якщо ж птиці захворіють і загинуть протягом 10 дн, роблять розтин В США прийнято таку оцінка інтенсивності змін (в балах): точні крововиливу або некротичні через трансформаційних змін в трахеї - 25; точкові крововиливи або некротичні зміни в трахеї і супутня їм набряклість трахеї і в області входу в грудну клітку - 100; точкові крововиливи або некротичні зміни в зобі - 100; некроз і виразка залоз сле-співай кишки і пеєрових бляшок - 100; точкові крововиливи або некротичні зраді-ня слизової оболонки клоаки - 10; запалення очеревини в області яєчника - 10; точкові крововиливи в інших місцях - 10. Діагностика VVND вважається обгрунтованою, якщо про-ний число балів досягає 150 або більше.