В процесі пересіву після тріпсінізаціі Ви можете оцінити стан клітинної культури, т. Е. Підрахувати загальну кількість клітин, а також виявити в їх числі мертві і живі клітини.
Для цих цілей існує простий метод підрахунку клітин в гемоцітометре (камері Горяєва).
В клітинну суспензію додають рівний об'єм 0,1% -ного трипанового синього. Цей барвник забарвлює тільки мертві клітини.
Шліфоване покривне скло притирають до предметного скла гемоцітометра (біла стрілка) до появи кілець Ньютона, так, щоб покрити заштриховані області (блакитна стрілка).
Це призводить до утворення камери з фіксованим обсягом, оскільки краю предметного скла підняті над заштрихованої поверхнею рівно на 0,1 мм.
Кожна заштрихована область складається з 9 великих квадратів розміром 1х1, т. Е. Обсяг, обмежений кожним великим квадратом, виявляється рівним 1мм х 1мм х 0,1 мм = 0,1 мм 3.
Відбирають частина пофарбованої суспензії пастерівської піпеткою і заповнюють лічильну камеру гемоцітометра, використовуючи капілярне всмоктування, що не переповняючи канали камер.
Підрахунок живих клітин в гемоцітометре (по R.L.P. Adams)
Підраховують кількість клітин в чотирьох великих квадратах в кутах кожної з двох заштрихованих областей.
Вважають клітини, що стосуються правої і верхньої обмежують ліній, але не клітини, що стосуються лівої і нижньої обмежують ліній.
Оскільки обсяг великого квадрата становить 0,1 мм 3. то, помноживши усереднене значення числа клітин в одному квадраті на 10 4. отримують кількість клітин в 1 мл суспензії.
Порахуйте клітини під об'єктивом x10. Рахунок клітин проводите в чотирьох наборах із шістнадцяти маленьких квадратів (в кожному кутку центральної заштрихованої області). Вважайте тільки незабарвлені клітки. Розділивши отримане число на 4, отримаєте середнє число клітин на 1 мм 2. Оскільки висота камери становить 0,1 мм, то перерахункових коефіцієнт для гемоцітометра дорівнює 104. Припустимо, що отримане значення становить 20 клітин на 1 мм 2. Тоді 20х104 дорівнює числу клітин в 1 мл забарвлений-ної трипановим синім суспензії, а 2х20х104 дорівнює числу клітин в 1 мл вихідної суспензії, т. е. концентрація живих клітин у вихідній суспензії становить 4х10 5 клітин в 1 мл.
Одним з переваг клітинної культури перед іншими об'єктами дослідження є можливість тривалого спостереження за життєдіяльністю клітин, за станом окремих клітинних органел, за процесами, що йдуть в клітинах, фіксувати стан культури з урахуванням кількісних і якісних параметрів.
Для цих цілей можуть застосовуватися методи мікроскопії клітин (як прижиттєвої, так і після фіксації) і фотографування.
Перша фотографія клітини, отримана під електронним мікроскопом, була зроблена в 1945 році Кейтом Р. Портером, Альбером Клодом і Ернестом Ф. Фулламом.
Найчастіше перед спостереженням в мікроскоп клітини фарбують.
Порівняйте дві фотографії клітинного моношару, отримані в нашій лабораторії (лінія СНЕВ).
Важко повірити, що на них одна і та ж культура. Справа в тому, що клітини пофарбовані різними барвниками.
барвник метиленовий фіолетовий
Індиго ядра клітин, а метиленовий фіолетовий структури клітини.
Також існують методи виборчого фарбування структурних компонентів клітини. Наведемо кілька прикладів.
Пофарбовані мітохондрії в культивованих фібробластах (барвник Родамін123. Флюорісцентним мікрографія. Douglas Wallace, Emory University, Atlanta)
Пофарбований ендоплазматичнийретикулум. Флюорісцентним мікрографія культивованої клітини ссавця, пофарбованої за допомогою антитіл, що зв'язуються з білками в ЕПР. Hugh Pelham
Клітка ссавця. Відповідність в клітинної локалізації мітохондрій
(Зліва; барвник Родамін123: прижиттєве фарбування, світлова мікроскопія)
і мікротрубочками (праворуч; іммунофлюорісцентная мікрографія після фіксації; клітина забарвлена флюорісцентним антитілами до микротрубочкам. Lan Bo Chen).
Зафіксована пофарбована (Кумассі синій) клітина. Виборче фарбування білків цитоскелету. Colin Smith.
Фібробласт. Микротрубочки (зелений колір; пофарбовані антитілами до тубуліну) в інтерфазі. Ядро (синьо-зелений колір) забарвлене флуоресцентним барвником до ДНК. Nancy L. Kedersha.
Існують методи прижиттєвого фарбування клітин з метою розрізнити мертві і живі клітини. Деякі фірми для цих цілей випускають спеціальні набори.
Наприклад, такі тести пропонує фірма Molecular Probes Europe BV.
PtK2 клітини, забарвлені з використанням LIVE / DEAD EukoLight Viability Kit, при цьому мертві клітини фарбуються в червоний колір, а живі - в зелений.
Клітини бичачої сперми, пофарбовані з використанням LIVE / DEAD FertiLight Sherm Viability Kit. Живі клітини зеленого кольору.