Метою цієї роботи була розробка методики кількісного визначення широкого спектру генотипів ВПЛ високого онкогенного ризику (12 типів) на основі технології ПЛР в реальному часі і оцінка її клінічних характеристик в умовах скринінгу.
матеріали та методи
В якості методу для виявлення і кількісного визначення ДНК ВПЛ використовувалася полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі. У розробленій для цих цілей тест-системі «Амплісенс ВПЛ ВКР Скрін-Титр FRT», використовується принцип ампліфікації з вищепленію 5'-кінцевий мітки специфічного зонда (TaqMan Assay) і принцип группоспецифических олігонуклеотидів, здатних ампліфікувати фрагменти ДНК декількох представників філогенетичної групи. Кількісне визначення засноване на використанні стандартних зразків з відомою концентрацією ДНК ВПЛ та ДНК людини. Результат розраховується в логарифмах геномних еквівалентів вірусу (ГЕ) нормалізованих на 100 тисяч (105) геномів людини. Нормалізація на кількість геномів дозволяє нівелювати ефект варіацій забору клінічного матеріалу. Поріг релевантного кількості вірусу приймався рівним 103 Гена 105 геномів людини, що приблизно відповідає (при використанні запропонованого нами методу взяття зразків (цервікальний цитологічний зонд поміщається в 500 мкл транспортної середовища з Муколитики (транспортне середовище «АмпліСенс» -жіноча, виробництва ФГУН ЦНІІЕ) і зберігається до доставки в лабораторію) і методу екстракції ДНК (сорбція на частинках силикагеля, ДНК-сорбіт-АМ і ДНК-сорбіт-Д, ФГУН ЦНІІЕ)) порогу в 1 пг / мл ДНК ВПЛ, описаного Snijders і Lorincz як поріг релевантного кількості ві вуса. Оцінка можливостей кількісної оцінки проведена на 99 зразках, охарактеризованих методом рідинної цитології і гістології як H-SIL або РШМ і 305 зразках охарактеризованих як норма або реактивні зміни. Всі зразки були отримані від пацієнток, що проходять обстеження в центрі патології шийки матки, кафедра акушерства та гінекології МДМСУ.
результати
В ході дослідження за допомогою розробленої методики зразків H-SIL і РШМ ДНК ВПЛ виявлено у 99,0% випадків (98 з 99), при введенні кількісного порогу 103 ГЕВПЧ (3lg) на 105 геномів - в 98,0% (97 з 99 ). В одному зразку вірусне навантаження склала 2,9 lg, що виявилося на 0,1 нижче порогового значення. При спробі підвищити граничне значення до 104 ГЕВПЧ (4lg) на 105 геномів кількість виявлених випадків H-SIL склало 84,8% (84 з 99). Таким чином, в разі тяжкої дисплазії і раку вірусне навантаження практично ніколи не виявляється нижче порога 103 ГЕВПЧ (3lg) на 105 геномів, при цьому спроба підвищити даний поріг призводить до втрати чутливості.
При дослідженні зразків норми або реактивних змін ДНК ВПЛ виявлено у 36,8% зразків (112 з 305) (діагностична специфічність по відношенню до виявлення дисплазії ШМ - 63,2%). Введення порога клінічної значущості на рівні 103 ГЕ ВПЛ (3lg) на 105 геномів дозволило відсікти 51% ВПЛ позитивних зразків з діагнозом норма або реактивні (57 з 112) як містять незначна кількість вірусу. Таким чином, при використанні порогу клінічної значущості ДНК ВПЛ в зразках норми або з реактивними змінами виявляється в 18,1% (55 з 305), діагностична специфічність збільшилася на 18,7% і склала 81,9%.
висновок
Нами була розроблена методика кількісного визначення 12 генотипів ДНК ВПЛ на основі ПЛР в режимі реального часу і показано, що введення порогу клінічно значної кількості вірусу на рівні 103 ГЕ на 105 геномів людини дозволяє підвищити специфічність дослідження з 63,2% до 81,9% при збереженні чутливості на високому рівні - 98%. Таким чином, введення порогу вірусного навантаження може бути рекомендовано для проведення більш специфічного скринінгу.
About Беркегейм Михайло
Цей cайт - мій особистий досвід в лікуванні людей. Тут ви можете знайти величезну кількість статей з медицини. Я допоможу вирішити вам ваші проблеми, створити сім'ю, спланувати дитини. Я багато років займаюся лікуванням бесплодія.Ви можете самі вибрати стать вашої дитини і дату його народження. Я допоможу вам налагодити стосунки в родині. Лікування безпліддя в Москві не просто, проте практично всі мої клієнти з часом знаходять радість материнства.
Фотографії з flick r
Пошук по сайту
Мої інтереси
Запис на прийом: +7 (926) 221 14 39