5. Технології приготування тимчасових і постійних препаратів біологічних об'єктів для проведення світлової мікроскопії.
1) Тимчасові препарати
Для вивчення рослинних об'єктів за допомогою світлового мікроскопа необхідно приготувати микропрепарат. Мікропрепарати, не призначені для тривалого зберігання, називаються тимчасовими. Досліджуваний об'єкт поміщають на предметне скло в краплю води, гліцерину, розчину, реактиву або барвника і накривають покривним склом. Такі препарати можна зберігати протягом кількох днів, помістивши у вологу атмосферу.
2) Постійні препарати
Постійні препарати готуються за спеціальними методиками, які забезпечують їх зберігання протягом десятків років. До постійних препаратів належать мазки, тотальні препарати і зрізи. Мазки використовуються при вивченні клітин крові, культур мікроорганізмів, ізольованих тканинних клітин. Тотальні препарати представляють собою окремі прозорі і тонкі об'єкти Навчальні зрізи можна зробити вручну, за допомогою бритви. Однак якісні зрізи із заданою товщиною 10. 22 мікрометра зазвичай виготовляють за допомогою спеціальних приладів - мікротомів. Такі зрізи часто називають мікротомних препаратами. Для отримання більш тонких зрізів (0,01. 0,05 мкм, або 10. 50 нанометрів) використовують ультрамікротоми.
Коротко розглянемо основні етапи приготування постійних препаратів.
1. Фіксація матеріалу. Відразу після закінчення фіксації проводиться промивка матеріалу або водою (після водних фіксаторів), або 80% -ним спиртом (після спиртових фіксаторів). Кількість змін промивних рідин - не менше 3. Час - до 24 годин.
2. Зневоднення в спиртах зростаючої концентрації. Паралельно відбувається ущільнення матеріалу. Послідовне переміщення матеріалу через ряд розчинів називається проводка. Після водних фіксаторів використовується 8 змін спирту: 20%, 40%, 80%, дві зміни по 96%, дві зміни по 100%. Після спиртових фіксаторів - 4 зміни спирту. дві зміни по 96% і дві зміни по 100%. У кожній зміні матеріал витримується по 1 годині.
3. Просвітлення. Це просочування матеріалу розчинником парафіну - ксилолом (бензолом, хлороформом). Зразок поміщається на 1 годину послідовно в кожний з наступних розчинів: 3 частини спирту + 1 частина ксилолу, потім 2 частини спирту + 2 частини ксилолу, потім 1 частина спирту + 3 частини ксилолу, потім дві зміни ксилолу.
4. Заливка в парафін. Це заміщення ксилолу парафіном. Зразок поміщають в суміш ксилолу та парафіну при температурі 55. 57 градусів і залишають в термостаті при цій температурі до повного випаровування ксилолу (від декількох годин до декількох діб). Потім при температурі 55. 57 градусів виробляється проводка через парафін I (6. 12 годин), парафін II (6. 12 годин) і заливка в парафін III. Парафін I, II, III відрізняються тільки чистотою: парафін III - це остаточна середовище, яке має володіти найбільшою чистотою. У підсумку виходять парафінові блоки, в яких укладені зразки матеріалу. Ці блоки можна різати в будь-якому напрямку.
5. Фарбування зрізів. Парафінові зрізи наклеюють на чисте предметне скло. В якості клею можна використовувати суміш білка курячого яйця з гліцерином (в співвідношенні 1. 2) з додаванням антисептика (тимолу або фенолу). Зазвичай виробляють депарафінірованіе зрізів. Для цього скла з наклеєними зрізами проводять через ксилол, спирти спадної концентрації (100%, 96%, 80%, 70%) і дистильовану воду. Час перебування в кожному середовищі - 2. 3 хвилини. Далі забарвлюють згідно методикам.
6. Зневоднення і просвітлення забарвлених зрізів. Виконується шляхом проводки через спирти зростаючої концентрації, а потім через ксилол.
7. Висновок в середовища (заливка). Для тривалого зберігання препаратів їх необхідно укласти в середу, що охороняє препарат від окислення повітрям і від ураження грибками. Для заливки використовуються спеціальні смоли (канадський бальзам, смерековий бальзам), які розчиняють в ксилолі до консистенції рідкого меду. Краплю такого розчину наносять на зріз і покривають покривним склом.
6. Хімічний склад клітинного речовини. Мікро і макроелементи.
У складі клітини виявлено понад 80 хімічних елементів, при цьому будь-яких спеуіальних елементів, характерних тільки для живих організмів, не виявлено. Однак, тільки в відношенні 27 елементів відомо, які функції вони виконують. інші 53 елемента, ймовірно, потрапляють в організм із зовнішнього середовища.
За змістом елементи, що входять до складу клітини, можна розділити на три групи:
1. Макроелементи
2. Мікроелементи До них відносяться переважно атоми металів, що входять до складу ферментів, гормонів і
інших життєво важливих речовин. В організмі ці елементи містяться в дуже невеликих кількостях: від 0,001 до 0,000001%; в числі таких елементів бор, кобальт, мідь, молібден, цинк, йод, бром та ін.
3. ультрамікроелементи
Концентрація їх не перевищує 0,000001%. До них відносять уран, радій, золото, ртуть, берилій, цезій та інші рідкісні елементи. Фізіологічна роль більшості цих елементів в організмах рослин, тварин, грибів і бактерій поки не встановлена.