ТЕМА: МІКРОБІОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА БАКТЕРІАЛЬНОЇ ДИЗЕНТЕРІЇ.
Мета. вивчити етіологічну структуру бактеріальної дизентерії, біологічні властивості збудників. Вивчити основні принципи діагностики та вміти провести ідентифікацію виділеної культури.
Бактеріальна дизентерія - поліетіологічне антропонозное захворювання, яке викликається декількома видами шигел і з переважним ураженням товстого кишечника. Загальні властивості всіх шигелл - відсутність джгутиків, менш виражена в порівнянні з іншими ентеробактеріями ферментативна активність, наявність тільки О-антигену.
За біохімічної активності і антигенної структурі все шигели діляться на 4 групи: А, В, С, D. До кожної групи належать різні серовар одного виду.
Міжнародна класифікація шигел
A - Shigella dysenteriae
B - Shigella flexneri
C - Shigella boydii
D - Shigella sonnei
Вірулентність шигелл визначається наявністю факторів адгезії і колонізації, за допомогою яких шигели проникають в епітелій товстого кишечника і розмножуються в ньому. Надалі розвивається гіперчутливість уповільненого типу (ГЗТ) або інфекційна алергія, що призводить до розвитку виразкового коліту.
Токсигенність шигелл пов'язана з утворенням ендотоксину (ЛПС) і екзотоксинів 2х типів: ентеротоксину і цитотоксину. Цитотоксин продукує Shigella dysenteriae (Грігорьева- Шига).
Особливістю епідеміології дизентерії є зникнення в 40х роках Shigella dysenteriae і потім повернення її в 60-80х роках.
Лабораторна діагностика бактеріальної дизентерії проводиться трьома основними методами: бактеріологічним, серологічним і алергічних. Основний метод діагностікі- бактеріологіческій- проводять посів випорожнень на елективні та диференційно діагностичні поживні середовища (селенітовий середу збагачення, середовища Плоскірєва, Ендо і Левіна). Слід зазначити, що виделяемость антібіотікозавісімих штамів шигел зростає при посіві випорожнень на середовища, що містять левоміцетин і тетрациклін (25мкг / л).
З метою серодиагностики ставлять реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА).
Аллергодіагностіка- ставлять внутрішньошкірну пробу з дізентеріном з 3 - 5 - го дня захворювання (проба Цуверкалова).Самостійна робота студентів
Розібрати і замалювати в зошит схему мікробіологічної діагностики бактеріальної дизентерії.
Провести посів випорожнень хворого з підозрою на бактеріальну дизентерію на диференційно діагностичні середовища Плоскірєва або Ендо.
Вивчити характер росту на середовищі Плоскірєва (вивчення культуральних властивостей).
З частини безбарвної S- форми колоній (L- дефективних колонії) на середовищі Плоскірєва приготувати мазок, забарвити за Грамом і промікроскопувати (вивчення морфологічних ітинкторіальних властивостей).
Постановка орієнтовною реакції аглютинації на склі з сумішшю дизентерійних сироваток (Флекснера, Зонне) імонорецепторние сироваткою.
Для виділення чистої культури решту лактозодефектівной колонії (Ld-колонії) пересівають на середовище Ресселя.
Мікроскопічне вивчення чистоти виділеної культури.
Вивчення ферментативних властивостей виділеної культури-пересівши на диференційно діагностичні середовища Гіссен.
Визначення чутливості виділеної культури до антибіотиків диско-дифузійним методом (метод паперових дисків) і фаголізабельність.
Схема 3. Мікробіологічне дослідження при дизентерії
Реакція аглютинації (по типу реакції Відаля) з дізентірійнимі діагностикумами, РПГА з
Посів на диференціальні середовища (Плоскірєва і ін.)
Характер і колір колоній
Мазок, забарвлення за Грамом
Реакція аглютинації на склі з сумішшю дизентерійних сироваток
колоній на середу Ресселя або Трьохцукровий середу
Мазок, забарвлення за Грамом
Посів на «строкатий» ряд
Реакція аглютинації на склі з сумішшю дізентірійних сироваток, а потім з видовими і типовими
Вказівки до самостійної роботи
1-й день: Екскременти хворого засівають на диференційно діагностичні середовища Плоскірєва або Ендо. При наявності в досліджуваних випорожненнях гнійних або слизово-кров'яних грудочок, їх вибирають бактеріологічною петлею, промивають у фізіологічному розчині хлориду натрію і наносять на поверхню середовища Плоскірєва або Ендо, після чого розтирають шпателем. Посіви інкубують в термостаті при t - 37 ° С 24 години.
2-й день: а) прозорі безбарвні колонії пересівають на середовище Ресселя для виділення чистої культури;
б) частину, що залишилася ізольованою колонії використовують для постановки орієнтовною реакції аглютинації на склі з сумішшю дизентерійних сироваток і з сумішшю сироваток проти сальмонел (для виключення черевного тифу і сальмонельозу).
3-й день: а) через 24 години на середовищі Ресселя - стовпчик агару посиніє.
б) виділену культуру пересівають на диференційно діагностичні середовища Гіссен або МТС - 5У;
в) визначають чутливості виділеної культури до антибіотиків диско-дифузійним методом і фаголізабельність.
4-й день: Остаточний висновок за результатами визначення біохімічних властивостей, чутливості до антибіотиків і фаголізабельність.
Примітка: випорожнення беруть безпосередньо біля ліжка хворого через нестійкість шигелл у зовнішньому середовищі.
Питання для самоконтролю:
Наведіть сучасну Міжнародну класифікацію шигелл.
Які властивості покладені в основу класифікації шигелл?
Як відрізняються різні види дизентерійних бактерій за біохімічними властивостями?
Який вид дизентерійних паличок продукує екзотоксин?
Перерахуйте основні методи мікробіологічної діагностики бактеріальної дизентерії.
Які шигели найбільш часто викликають бактеріальну дизентерію в даний час.
Як і який матеріал беруть на дослідження для виділення чистої культури і на які поживні середовища його засівають?
Препарати для специфічної профілактики і лікування бактеріальної дизентерії.
заняття 6
ТЕМА: МІКРОБІОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА ХОЛЕРИ.
Мета: вивчити методи мікробіологічної діагностики холери. Ознайомитися з методами специфічної профілактики і терапії холери.
Холера - гостре антропонозное особливо небезпечне карантинне інфекційне захворювання, що характеризується клінічними симптомами гастроентериту з різким зневодненням і важкою інтоксикацією.
Вид Vibrio cholerae має 4 биовара: cholerae, eltor, proteus (вібріон Мечникова), albensis (світиться вібріон). Холеру викликають 2 биовара: cholerae і eltor. Холерний вібріон монотріх, дуже рухливий, вимогливий до PH, зростає на лужних середовищах, має високу біохімічної активністю. По відношенню до трьох углеводам- сахарозі, маноза і арабінозу все вібріони діляться на 8 груп (по Хейбергом). Біовари cholerae і eltor відносяться до I групи Хейберга: розщеплюють до кислоти без газу сахарозу і манозу і не розщеплюють арабинозу.
Вірулентність холерного вібріона обумовлена двома токсинами: ендотоксинів і екзотоксину. Провідну роль в патогенезі захворювання відіграє екзотоксин-холероген. Він викликає цитотоксичний ефект -Втрата організмом рідини і солей натрію, калію, що є головною причиною розвитку алгід і смерті хворого.
Діагностика холери проводиться бактеріологічним методом. Матеріалом для дослідження служать випорожнення, блювотні маси, харчові продукти, трупний матеріал і ін.
Живильні середовища для культивування холерного вібріона: 1% лужна пептонна вода, лужний агар, середа ТЦБС.
Самостійна робота студентів.
Замалювати в зошит схему мікробіологічної діагностики холери.
На першому етапі досліджуваний матеріал вивчають в мазках, пофарбованих за Грамом і методом «роздавлена» і «висить» крапля, а потім засівають на 1% лужну пептони воду і щільні поживні середовища.
Для накопичення матеріалу культуру пересівають на нову пептонную воду і ще раз на пластинчасті середовища. Виділяють чисту культуру.
Виділену культуру ідентифікують за морфологічними і тинкторіальними (мікроскопія мазків, пофарбованих за Грамом), культуральним, біохімічними та антигенними властивостями.
Серовар Vibrio cholerae визначають в реакції аглютинації на склі з аглютинативна сироватками Інаба, Огава, Гікошіма.
Біохімічні властивості визначають до вуглеводів: сахароза, манноза, арабиноза.
Вивчення препаратів для профілактики і терапії холери.
Оформлення протоколу дослідження.
Схема 4. Мікробіологічне дослідження при холері
Випорожнення, блювотні маси, жовч, патологоанатомічний матеріал, вода і ін.
Таким чином, ідентифікацію культур проводять в 3 етапи: 1) встановлюють їх приналежність до роду Vibrio; 2) диференціюють їх від холероподобних вібріонів в РА з О-сироваткою, по чутливості до специфічного фагу і іншими тестами; 3) визначають видові властивості культур.
Остаточну відповідь про виділення та ідентифікації виділеної культури дають через 36-48 годин.
III. Експрес - методи діагностики.
Іммобілізація холерних вібріонів протихолерні сироватками.
Методика: при приміщенні холерних вібріонів в сироватку імунну (містить антитіла проти V.cholerae), вони втрачають рухливість (визначають в «висячої» і «роздавленої» краплі).
РИФ (реакція імунофлюоресценції).
Методика: препарати з досліджуваного матеріалу обробляють флюоресцирующей протихолерної сироваткою і досліджують в люмінесцентному мікроскопі.
Позитивний результат-виявлення в препараті навіть одиничних вібріонів з яскравим жовто-зеленим світінням у вигляді блискучого обідка по периферії клітини.
ДНК - діагностика - використання молекулярно-генетичного методу - ПЛР - полімеразно-ланцюгова реакція.
IV. серологічні методи
Є допоміжним методом і застосовується для ретроспективної діагностики холери, а також для виявлення вібріононосіїв і оцінки напруженості постинфекционного і поствакцинального імунітету. Серодиагностика проводиться постановкою РА або РНГА (реакція непрямої гемаглютинації) з еритроцитарних діагностикумів.
Реакцію ставлять на плексігласовий панелях, в ямочки яких отримують розведення досліджуваної сироватки, до яких додають 0,5 мл 3% суспензії еритроцитарного диагностикума.
Позитивний результат - еритроцити випадають в осад у вигляді «парасольки».
Негативний результат - еритроцити випадають в осад у вигляді «гудзика».
Таблиця 11
Препарати для профілактики та терапії холери
Питання для самоконтролю:
Вкажіть таксономию (сімейство, рід, вид) збудників холери.
Які морфологічні, тинкторіальних і культуральні, властивості холерного вібріона?
Біохімічні властивості холерного вібріона. Що таке «тріада Хейберга»?
На чому грунтується поділ V.cholerae на серовар?
Тести відмінності биоваров V.cholerae.
Які токсини утворює холерний вібріон?
Джерела і шляхи зараження холерою.
Які правила слід дотримуватися при взятті, пересилання і дослідження матеріалу при підозрі на холеру?
Чи можна проводити дослідження на холеру в звичайних лабораторіях. Якщо ні, то чому?
Відмінності холерного вібріона від холероподобних вібріонів.
Назвіть препарати, які використовуються для специфічної профілактики і лікування холери.
заняття 7
ПІДСУМКОВЕ ЗАНЯТТЯ ПО ПОДІЛУ: «МІКРОБІОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА кишкові ІНФЕКЦІЙ»
Мета: контроль знань студентів за розробленими на кафедрі тестовим занять 1-2 рівня.
заняття 8
Тема: МІКРОБІОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА СТАФІЛОКОКОВОЇ ІНФЕКЦІЇ. БАКТЕРІОЛОГІЧНА ДОСЛІДЖЕННЯ ГНОЮ (1 ДЕНЬ ДОСЛІДЖЕННЯ)
Мета: 1.Изучить методи мікробіологічної діагностики стафілококових інфекцій.
2.Ознакоміться з методами специфічної профілактики і терапії стафілококових інфекцій.
Серед великого числа кулястих бактерій широко поширених в природі, лише деякі патогенні для людини. Запальні процеси, викликані цими мікроорганізмами, зазвичай супроводжуються утворенням гною, внаслідок чого їх називають гнійними або піогенними кокками.
Стафілококи (Staphylococcus) - круглі коки, які мають в культурі у вигляді купок, що нагадують виноградні грона, а в патологічному матеріалі - у вигляді невеликих скупчень по кілька коків; нерухомі, спор не мають, капсул не утворюють, грампозитивні.
Серед що не утворюють спор бактерій, стафілококи найбільш стійкі до різних фізичних і хімічних факторів. Вони є факультативними анаеробами, але краще розвиваються в аеробних умовах. Мають значну хімічну активність, розкладають ряд вуглеводів, розріджують желатину. Діагностичне значення має здатність зброджувати глюкозу і маніт в анаеробних умовах. На поверхні щільних поживних середовищ утворюють круглі, опуклі, пігментовані (золотисті, палеві, лимонно-жовті, білі) колонії з рівними краями; в рідких середовищах дають рівномірне помутніння. У лабораторіях використовують здатність стафілококів розмножуватися на середовищах з великою кількістю (6-10%) хлориду натрію. На таких середовищах інші бактерії не ростуть, внаслідок чого сольові середовища є елективні для стафілококів. Рід Staphylococcus включає 19 видів, з них тільки 3 екологічно пов'язані з організмом людини: S-aureus - стафілокок золотистий, S. epidermidis - стафілокок епідермальний і S. saprophyticus - стафілокок сапрофітний. Захворювання, що відрізняються різноманітністю клінічних проявів, викликають золотисті, рідше епідермальні і ще рідше сапрофітні стафілококи.
Шкідлива дія на клітини і тканини організму людини надають токсини і ферменти стафілококів.
Золотисті стафілококи здатні виділяти ряд токсинів, зокрема лейкоцідін, який надає згубну дію на лейкоцити. Гемолізіни надають лізуючого дію на еритроцити.
Виникнення харчових отруєнь стафілококової природи пов'язано з дією ентеротоксінов. продукуються золотистими стафілококами. У патогенезі стафілококових інфекцій велику роль відіграють екзоферменти:
- плазмокоогулаза здійснює згортання плазми;
- гиалуронидаза сприяє поширенню стафілококів в тканинах;
- лецитиназа руйнує лецитин, що входить до складу оболонок клітин, викликає лейкопенію;
- фибринолизин розчиняє фібрин, що обмежує місцевий запальний осередок, ніж сприяє генералізації патологічного процесу.
Стафілококи широко поширені в навколишньому середовищі - повітрі. пилу і т. д. У людини вони завжди знаходяться на шкірі, а також в сполучених із зовнішнім середовищем порожнинах (ротової і носової) в якості нешкідливих мешканців. У разі будь-яких загальних порушень в організмі або при пошкодженнях шкірних і слизових покривів стафілококи можуть вражати будь-який орган і будь-яку тканину.
Самостійна робота
Скласти текст напрямки гною в бактеріологічну лабораторію.
Скласти схему мікробіологічного дослідження гнійних виділень, крові.
1-й день дослідження гною при гнійно-запальних захворюваннях:
а) приготувати мазок, забарвити за Грамом, промікроскопувати;
б) провести посів гною на середу ЖСА або кров'яний агар методом штриха;
в) УИРС «Визначення стафилококкового носійства у студентів». Взяти матеріал зі слизової зіву і носа один у одного стерильним ватним тампоном і зробити посів на чашку Петрі з ЖСА або кров'яним агаром.
г) зробити запис в протоколі дослідження (1-й день)
Схема 5. Мікробіологічне дослідження при стафілококових
кров при сепсисі
гній, ексудат, мокрота, слиз із зіву, носа і ін.
Мазок, забарвлення за Посів
Граму на ЖСА на кров'яний агар посів в цукровий бульйон
1-й етап Відповідь
Характер і Гемоліз