Гідроліз - розпад складної речовини на більш прості складові частини, пов'язаний з приєднанням води за місцем розриву зв'язків. Залежно від застосовуваного каталізатора розрізняють кислотний, лужний і ферментативний гідроліз. При гідролізі простого білка кінцевими продуктами є тільки амінокислоти. В організмі гідроліз білка постійно відбувається в процесі, як травлення, так і життєдіяльності клітин під дією протеолітичних ферментів.
При кислотному гідролізі білка руйнуються деякі амінокислоти: триптофан піддається повному руйнуванню, а серин, треонін, цистин, тирозин, фенілаланін - часткового. Однак відсоток руйнування цих амінокислот невеликий. При лужному гідролізі білка відзначається більш сильне руйнування амінокислот. Гідролізати білка застосовуються в якості лікувальних препаратів.
Лабораторна робота №9 кислотний гідроліз простого білка
При кислотному гідролізі білки розпадаються спочатку на високомолекулярні пептиди, потім на низькомолекулярні пептиди, дипептиди і, нарешті, на амінокислоти.
Повний гідроліз білка протікає при багатогодинному кип'ятінні розчину в круглодонной колбі з повітряним холодильнику в присутності соляної або сірчаної кислоти.
РЕАКТИВИ і ОБЛАДНАННЯ:
1) розчин яєчного білка; 2) HCl, конц .; 3) NaOH, 10%; 4) H2 SO4. 1%; 5) круглодонная колба з повітряним холодильником; 6) електрична плитка з азбестового сіткою; 7) штатив.
1. Кислотний гідроліз простого білка. Для гідролізу в круглодонную колбу відмірюють 20 мл розчину яєчного білка і 5 мл концентрованої соляної кислоти, колбу закривають пробкою з довгою скляною трубкою і закріплюють на штативі з азбестового сіткою. Вміст кип'ятять (під тягою) 45-90 хв.
2. Відкриття проміжних продуктів розпаду білка в гідролізаті за допомогою биуретовой реакції. Після закінчення кип'ятіння в пробірку наливають 5 крапель гідролізату білка і нейтралізують 10% розчином лугу по червоному лакмусу (опускають шматочок лакмусу в пробірку і помішують скляною паличкою). Після нейтралізації гідролізату (при посиніння лакмусу) проводять біуретову реакцію, додаючи 2 краплі CuSO4.
Проміжні продукти розпаду білка - пептони - при проведенні биуретовой реакції дають рожеве або червоне забарвлення, а білки - синьо-фіолетове.
При повному гідролізі білка (2,5 години до амінокислот биуретовая реакція з гидролизатом білка негативна.
Після закінчення гідролізу гідролізат використовують для лабораторної роботи №10.
Лабораторна робота №10 формоловая титрування (по Серенсену)
При гідролізі білка внаслідок розриву пептидних зв'язків в ньому відбувається наростання одночасно карбоксильних і амінних груп в еквівалентних кількостях. Для визначення кількості карбоксильних груп використовується метод Серенсена.
Амінокислоти у водних розчинах утворюють внутрішньо-молекулярні солі, тому без попереднього блокування аміногруп формальдегідом безпосередньо титрувати карбоксильні групи амінокислот лугом неможливо. В процесі реакції з формальдегідом аминогруппа втрачає свої основні властивості.
Утворюється метиленовими з'єднання (метіленамінокіслота) легко може бути відтитрувати лугом.
Визначаючи кількість карбоксильних груп титруванням, одночасно можна судити і про зміст амінних груп, так як кількість тітруемих карбоксильних груп еквівалентно кількості пов'язаних формальдегідом амінних груп. Метод формоловая титрування дозволяє стежити за ходом гідролізу білка і вивчати дію протеолітичних ферментів.
Кінець гідролізу білка збігається з моментом, коли кількість амінних і карбоксильних груп в гідролізаті перестане збільшуватися і спостерігається негативна биуретовая реакція.
РЕАКТИВИ і ОБЛАДНАННЯ:
1) тваринне вугілля, ретельно подрібнений; 2) CH3 COOH, 1%; 3) формалін нейтральний, 20%; 4) фенолфталеїн; 5) NaOH, 0,005 н .; 6) HCl або CH3 COOH, 1%; 7) конічні колби на 50 мл; 8) піпетки на 1 і 2 мл; 9) мікробюретки; 10) циліндр мірний на 25 мл.
1. Титрування карбоксильних груп в розчині білка до гідролізу. Відмірюють в колбочку 1 мл розчину яєчного білка, доливають 5 крапель 20% нейтрального розчину формаліну і 3 краплі 0,5% розчину фенолфталеїну. Титрують з мікробюретки 0,005 н. розчином NaOH до стійкої блідо-рожевого забарвлення.
2. Титрування карбоксильних груп після гідролізу білка (тобто в гідролізаті). Через 45 або 90 хвилин гідроліз переривають, а в колбу всипають (на кінчику ножа) тваринне вугілля для знебарвлення бурого розчину, збовтують і кип'ятять 5 хвилин. Потім гідролізат охолоджують, виливають в циліндр, доводять об'єм рідини до 25 мл дистильованою водою і фільтрують.
Відмірюють в колбочку 1,25 мл гідролізату, додають 3 краплі розчину фенолфталеїну і нейтралізують 10% розчином NaOH з макробюреткі до слабо-рожевого забарвлення. Якщо при нейтралізації забарвлення робиться яскраво-червоною, то додають до знебарвлення по краплях 1% розчин оцтової кислоти, надлишок якої нейтралізують 1% розчином NaOH до слабо-рожевого забарвлення. Потім доливають 5 крапель нейтрального 20% розчину формаліну і знебарвлений розчин титрують 0,005 н. розчином NaOH до блідо-рожевого кольору і точно відзначають кількість витраченої лугу.
3. Розрахунок азоту аміногруп виробляють за кількістю витраченої лугу, виходячи з її нормальності.
Заповнити таблицю 5.