Загальна рекомбінація при узгодженому внесення розривів і возз'єднання ланцюгів двох спіралей ДНК з утворенням протяжних гетеродуплексних областей. Щоб могла статися рекомбінація між подвійними спіралями, представлена на, кожна з чотирьох ланцюгів повинна бути розірвана і потім з'єднана з новим партнером. Відповідні ланцюга обох лінійних гомологічних дуплексів ДНК надрізають і вільні кінці однієї спіралі спаровуються з комплементарними ділянками іншого. Перехрест стабілізується сшиванием решт донорних ланцюгів з вільними кінцями реципієнтних спіралей. Точка перехрещення обмінюються ланцюгів переміщається уздовж спіралей - процес, званий міграцією гілки (е). При цьому відбувається одночасне розбіжність ланцюгів вихідних спіралей і їх реассоціаціі з новими партнерами з утворенням дочірніх дуплексів. Структури д і е, а також ж називаються структурами Холлідея на ім'я дослідника, вперше їх
який запропонував. Структури Холлідея можуть переходити в рекомбінантні подвійніспіралі шляхом внесення розриву і возз'єднання ланцюгів двома альтернативними способами. Один спосіб полягає в розрізуванні і возз'єднання перехрещуються ланцюгів. Два реципрокних продукту л і м можуть утворитися, якщо розрив і подальше возз'єднання ланцюгів відбудуться в точці перехрещення в структурах е і д або по лінії перетину чотирьох ланцюгів в ізомерної структурі Холлідея і. Розмір обмінюються фрагментів залежить від відстані, на яке відбулася міграція гілки до акту рекомбінації. Альтернативні продукти н і про утворюються в тому випадку, якщо структура Холлідея з переходить в результаті розриву в к. В основі рекомбінації даного типу лежить гомологичное спаровування ланцюгів, що належать двом різним спіралям ДНК, тому швидше за все вона відбудеться в тому місці, де таке спаровування можливо a priori і де гомологичность послідовно ності досить велика, щоб могла статися міграція
гілки в рамках структури зі схрестилися ланцюгами. Звідси можна зрозуміти, чому загальна, або гомологичная, рекомбінація відбувається також між двома повторами в межах однієї молекули ДНК або між аллельними і неалельних елементами однієї і тієї ж послідовності в двох різних хромосомах.
В ході міграції гілки при спарюванні ланцюгів, що належать різним спіралям, утворюються гетеродуплекси. У таких гетеродуплексах в межах сегмента між сайтом початку утворення структури Холлідея і сайтом кросинговеру може міститися по одному або більше помилково спарених підстав. Вони видаляються так само, як будь-які модифіковані підстави при репарації ДНК. Однак, оскільки видалено може бути будь-яка з помилково спарених підстав, в обох рекомбінантних спіралях в даному сайті можуть виявитися однакові пари підстав, тобто рекомбінація для цього сайту виявиться нереціпрокной. Таким чином, кожна з рекомбінантних спіралей може бути схожа на будь-який
з початкових дуплексів в тих позиціях, де початково вони розрізнялися.
Загальна рекомбінація з утворенням двухцепочечную розриву.
Альтернативний механізм загальної рекомбінації включає освіту двухцепочечную розриву в одному з дуплексів-партнерів. Далі за допомогою екзонуклеаза в місці розриву утворюється пролом. При спарюванні 3'-одноланцюжкові кінця проломи з комплементарної ланцюгом интактной спіралі в останній утворюється петля. Розмір цієї петлі збільшується в міру того, як ДНК-полімераза нарощує 3'-кінець «вклинившейся» ланцюга. В результаті інший одноланцюговий кінець проломи злучається з комплементарної послідовністю в переміщається петлі. В результаті такого спарювання утворюється система «праймер матриця», і ДНК-полімераза синтезує відсутню ланцюг, заповнюючи пролом. Лігування двох зростаючих решт з вихідними ланцюгами призводить до утворення подвійної структури Холлідея (тобто структури, в якій дві спіралі об'єднані двома перехрестився,
по одному на кожному кінці проломи). Міграція гілки в одному або обох перехрестився пересуває обидва місця зчеплення в будь-якому напрямку, при цьому в ділянках, що фланкують пролом, можуть виникати помилки. Поділ таких структур може йти двома способами - з перекрестом і без нього. з утворенням чотирьох дуплексів.
Необхідно відзначити деякі особливості цього механізму. Освіта помилкових пар (гетеродуплексов) в районах, що фланкують пролом, обумовлює отримання як реципрокних, так і нереціпрокних рекомбінації між генетичними маркерами. Якщо дволанцюжкові розрив відбувається поблизу (або в межах) ділянки, де між спіралями є відмінності (заміни підстав, делеции, вставки, інверсії і т.п.), то рекомбінанти успадкують нуклеотидную послідовність
партнера, у якого розриву не відбувалося. Цей механізм пояснює багато випадків генної конверсії, особливо ті, в яких протяжна послідовність одного дуплексу заміщається відповідною, але відрізняється послідовністю іншого
дуплексу.
Нереціпрокная загальна рекомбінація використовується і при репарації деяких пошкоджень ДНК. Наприклад, якщо тимінових димери не були видалені з УФ-опроміненої ДНК до того, як до них підійшла репликативная вилка, то синтез комплементарної ланцюга в цій ділянці не може бути завершений. Оскільки тимінових димери, що знаходяться навпроти проломи, не можуть бути ви-
Щеплев, залишається один шлях для порятунку хроматиди - використовувати генетичну інформацію гомологичной сестринської хроматиди і заповнити пролом. Для цього застосовується такий же механізм, як для репарації проломів.
в.
Ферменти, що беруть участь в загальній рекомбінації.
У загальній рекомбінації беруть участь два специфічних ферменту і ще кілька ферментів, які каталізують також процеси реплікації і репарації ДНК. Ензимологія загальної рекомбінації вивчена тільки для деяких прокаріотів, зокрема E. coli і її фагів. Один зі специфічних ферментів, необхідних для успішної гомологічної рекомбінації, називається recА-білком.
Він каталізує обмін одиночними ланцюгами, використовуючи енергію гідролізу АТР до ADP і неорганічного фосфату. RecA-залежне впровадження одноланцюгових ДНК в дуплекс - перший етап рекомбінаційного процесу в рамках обох схем Холлідея і механізму з утворенням дволанцюжкових розривів. Другий фермент, що складається з трьох окремих субодиниць (В, С і D) і тому званий recBCD-нуклеаз, володіє ендо- та екзонуклеазной, а також геліказной активностями. Механізм його дії до кінця не встановлено, проте відомо, що
recBCD-нуклеаза індукує розриви в дуплексной ДНК і завдяки властивою їй геліказной активності разом з recА ініціює рекомбінаційний.
Ідентифіковано також фермент, що розрізає вузли в структурах Холлідея; при його участі утворюються липкі кінці, що з'єднуються лігази. У загальній рекомбінації беруть участь також гелікази і білки, що зв'язуються з одноцепочечной ДНК
(SSB; від англ. Single strand binding); обидва вони необхідні для забезпечення процесу міграції гілки.
Як відомо, переміщенню ланцюгів під час міграції гілки сприяє Pol I, а в воссоедіненііразорванних ланцюгів бере участь ДНК-лігаза. Для зняття топологічних обмежень при розкручуванні спіралі і для раcпутиванія перекручених структур, мабуть, потрібні топоізомераза типу I і, можливо, гіраза.
Гомологічних рекомбінація в репарації ДНК
Швидко діляться бактеріальні клітини, що містять кілька репліконов, утворених недорепліцірованнимі хромосомами, більш стійкі до дії іонізуючої радіації, яка індукує дволанцюжкові розриви ДНК, ніж клітини з невеликим числом репліконов, що знаходяться в стаціонарній фазі.
Гаплоїдні клітини дріжджів в фазі G1 перед початком синтезу ДНК надзвичайно чутливі до дії іонізуючої радіації, тоді як ті ж клітини в фазі G2 перед митозом так само стійкі до іонізуючого випромінювання, як і диплоїдні клітини.
Ці факти вказують на те, що для ефективного виправлення
пошкоджень, що викликаються іонізуючою радіацією, необхідно одночасна присутність в клітці двох гомологічних молекул ДНК.
рис.1 Одна з моделей пояснюють репарацію дволанцюгових розривів.
Процес репарації умовно розділяється на три етапи:
1. Пресинаптическая фаза - відбувається внесення двухцепочечную розриву в ДНК або, при його наявності, відразу здійснюється нуклеазного розщеплення кінців розриву. У створенні одноланцюгових 3'-OH-виступаючих кінців ДНК в місці розриву бере участь білок RecBCD, який володіє як геліказной, так і екзонуклеазной активностями. RecBCD розплітає двухцепочечную молекулу ДНК в місці розриву і гідролізує одну з ланцюгів в напрямку 5 '> 3', залишаючи виступаючий одноланцюговий ділянку.
2. Синаптична фаза - відбувається сінапсіс гомологічних ділянок двох молекул ДНК з входженням комплементарного
одноланцюжкові ділянки в ДНК-дуплекс і подальшим репаративну синтезом ДНК. Пошук гомологічних ділянок і обмін ланцюгами, необхідні для рекомбінації, відбуваються за участю білка RecA.
3. Постсинаптическая фаза - утворилися структури Холідея поділяються за допомогою білків RuvA, -B і -C, RecG, а також білків SOS-системи репарації (RecN, UvrD, RecF і RecJ). Схожі механізми використовуються клітинами для рекомбинационной репарації одноланцюгових проломів, що залишаються в молекулах ДНК через блокування репликативного синтезу ДНК модифікованими нуклеотидами.
Багато продуктів генів E. coli і дріжджів, які беруть участь в рекомбинационной репарації пошкоджень ДНК, мають гомологи у тварин і людини. Відмінною особливістю еукаріотичної рекомбінації і репарації є входження відповідних білків в численні білкові комплекси, зокрема транскріптосоми і реплісоми, що
вказує на їх важливу роль в матричному біосинтезі нуклеїнових кислот еукаріотів.
Механізм сайт-специфічної рекомбінації
Сайт-специфічна рекомбінація відбувається між специфічними сегментами дуплексів ДНК, що не мають протяжних гомологічних ділянок. Характерним прикладом такої рекомбінації служить вбудовування кільцевої ДНК фага λ в хромосому Е. coli і її зворотне вищепленію. Рекомбінація відбувається в межах специфічної нуклеотидної послідовності ДНК фага λ (attP-сайт) та унікальною послідовності ДНК Е. coli (аttВ-сайт). Нуклеотидні послідовності attP- і attВ-сайтів зовсім різні, хоча мають загальне ядро (О) протяжністю в 15 нуклеотидних пар. AttP (POP ') простягається на 150 нуклеотидів вліво (Р) і на 75 нуклеотидів вправо (Р') від загального ядра, a attB (BOB ') - це сегмент довжиною всього близько 25 нуклеотидів, включаючи і ядро. Оскільки нуклеотидні послідовності, фланкирующие attP- і attВ-сайти зліва (attL) і праворуч (attR), для цих сайтів розрізняються, механізм рекомбінаційного вищепленію ДНК фага λ з ДНК Е. coli повинен відрізнятися від механізму їх рекомбинационной інтеграції. І дійсно, для рекомбінації між attL і attR при виключенні фаговой ДНК крім білка Int необхідні фагів білок xis і клітинний білок HF. Процес рекомбінаційного вищепленію, мабуть, має деяку схожість із процесом інтеграції, але роль зазначених трьох білків, особливо білка xis, все ще вивчається.
Негомологічних рекомбінація. Рекомбінація між негомологічних нуклеотидними послідовностями відбувається в клітинах прокаріотів і дріжджів досить рідко, а в клітинах ссавців - вельми часто. До негомологичной рекомбінації можна віднести процес випадкового вбудовування вірусної або плазмідної ДНК в ДНК клітин тварин, в результаті чого в реплицирующихся
геномах паповавирусов з'являється безліч делеций і дуплікацій. Кінці розірваної ДНК можуть з'єднатися, навіть якщо вони негомологічних. У деяких випадках рекомбінація відбувається між послідовностями, що містять кілька гомологічних пар основ, або між короткими частково гомологічними ділянками. Але, як правило, рекомбінують сегменти не мають гомоло-
гічної послідовностей.