В основі мутацій на молекулярному рівні лежать дві основні причини: помилки реплікації і мутагенні впливу різної природи. Помилки реплікації виникають через те, що точність функціонування ДНК-полімерази не є абсолютною. Оскільки вибір чергового нуклеотиду для включення в зростаючу ланцюг ДНК визначається в результаті взаємодії білків і ферментів системи реплікації і матричної ДНК, зміна властивостей цих білків або матриці як спонтанно, так і під дією різних модифікуючих агентів може призводити до помилок в реплікації ДНК і мутацій.
Помилки реплікації. Як вже обговорювалося в розділі 4.1, синтез ДНК відбувається в результаті послідовного ферментативного приєднання дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, комплементарних матричної ДНК, до 3'-кінцевого нуклеотиду ланцюга ДНК. Точність цього процесу визначається відмінностями в вільної енергії у канонічних або помилкових пар азотистих основ ДНК, що утворюються за правилами Уотсона-Кріка у водних розчинах. Відмінності складають 1-3 ккал / моль і забезпечують точність реплікації в межах не більше одного помилково включеного нуклеотиду на кожні 100 нуклеотидів.
Генетичні методи визначення частоти помилок реплікації, що виникають в процесі синтезу ДНК in vitro, бувають двох типів. При одному підході вимірюють частоту прямих мутацій, що призводять до інактивації будь-якого гена, зміна якого легко визначити фенотипически. Зручною системою, заснованої на такому принципі, є репликативная форма ДНК бактеріофага M13mp2, що містить частину гена -галактозидази у вигляді одноцепочечной проломи, забудовувати випробуваної ДНК-полімеразою в бесклеточной системі. Помилки синтезу ДНК в цьому випадку виявляють по втраті або зменшення активності -галактозидази, що не відбивається на життєздатності бактеріофага, який утворюється після введення такої ДНК в бактеріальні клітини за допомогою трансфекції. Із застосуванням цього методу виявляють до 200 різних замін підстав, а також делеции, мутації із зсувом рамок зчитування і складні генні перебудови.
При іншому підході до визначення точності синтезу ДНК in vitro вимірюють частоту зворотних мутацій, які відновлюють (під дією точковой мутації) послідовність нуклеотидів гена, активність білкового продукту якого була порушена в результаті, наприклад амбер-мутації. Цей метод має велику чутливість, дозволяючи визначати мутації, що відбуваються з частотами 10 -6 -10 -8 на нуклеотид за одну генерацію. Однак він обмежений можливістю визначення мутацій лише одного конкретного типу.
Частота помилок реплікації збільшується через спонтанні ушкоджень геномної ДНК, що виникають в результаті її депурінізаціі в фізіологічних умовах. Депурінізація є наслідком розриву N-гликозидной зв'язку, що з'єднує в молекулі ДНК пуринові основи із залишками дезоксирибози. За оцінками Ліндаль і Ніберг депурінізація ДНК в організмі відбувається з частотою 3 10 -11 на нуклеотид в секунду, що в 100 раз вище частоти спонтанної втрати піримідинових основ ДНК в тих же умовах. Простий розрахунок показує, що при такій частоті цих подій в соматичній клітині людини повинно відбуватися
10 5 депурінізацій / день. Реплікативний комплекс на ДНК-матриці взаємодіє з апурінізірованним сайтом і включає в синтезируемую ланцюг ДНК переважно залишки дезоксіаденозіна.
Багато бактеріальні та еукаріотичні ДНК-полімерази, що здійснюють реплікацію ДНК, мають 3'5'-екзонуклеазной коректує активністю, і тому помилково включені нуклеотиди, некомплементарни матриці, видаляються з 3'-кінця зростання ланцюга ДНК перед включенням наступного нуклеотиду в нерухомість, що будується ланцюг ДНК. Наявність у ДНК-полімеразної комплексів такої активності істотно підвищує точність функціонування систем реплікації.
Мутагенні впливу. Зусиль систем реплікації стає недостатньо в стресових ситуаціях, коли організм піддається масованому мутагенного впливу. Однак навіть присутність незначної кількості мутагенів у навколишньому середовищі викликає безперервне накопичення мутацій в геномі соматичних клітин, хоча і з невеликою швидкістю. Процес накопичення мутацій, які уникли корекції системами репарації, є кумулятивним - до раніше існуючих мутацій неухильно додаються нові, і сумарна кількість мутацій у геномі (генетичний вантаж) зростає. Процес накопичення мутацій - статистичний, тому в даний час можна прогнозувати лише ймовірність виникнення конкретної мутації в генетичному локусі або геномі організму. Оскільки мутації часто є причиною спадкових і набутих захворювань, важливо робити статистичний прогноз частоти виникнення певних захворювань у популяціях, для яких відома мутагенна екологічна обстановка.
Іонізуюче випромінювання. Яскраво вираженим мутагенну дію мають короткохвильове електромагнітне випромінювання (УФ-світло, рентгенівські промені), а також елементарні частинки, що утворюються в процесі радіоактивного розпаду речовини. За допомогою рентгенівського випромінювання Г. Меллером в 1927 р вперше були отримані мутації у дрозофіли. З тих пір дослідження механізмів мутагенезу проводяться всі інтенсивніше і в широких масштабах.
Електромагнітне випромінювання, що проходить через речовину, або елементарні частинки передають свою енергію атомам. В результаті первинного зіткнення з квантами випромінювання або частками з атома, який перетворюється в позитивно заряджений іон, вибиваються електрони. Звільнені електрони вдруге викликають утворення пар іонів при переміщенні до тих пір, поки їх енергія не вичерпається і вони не втратять свою іонізуючу здатність. Одиницею дози випромінювання служить рентген (Р) - кількість випромінювання, яке викликає утворення 2 · 10 9 пар іонів / см 3 повітря. На практиці часто користуються одиницею радий. служить мірою поглинання енергії; в повітрі 1 Р еквівалентний 0,876 радий. Для пояснення механізмів виникнення мутацій під дією іонізуючого випромінювання була застосована раніше розроблена теорія мішені. відповідно до якої пошкодження ДНК спостерігається в тому місці, де має місце первинна іонізація. Реакція відбувається всередині дискретного обсягу, що є мішенню. Пошкодження ДНК виникають як внаслідок прямого попадання кванта випромінювання або елементарної частинки в молекулу, так і в результаті вторинного дії іона, що утворився за межами ДНК в якомусь "чутливому обсязі". Встановлено, що частота мутацій, що виникають у дрозофіли та інших об'єктів, прямо пропорційна дозі опромінення. Певна доза опромінення викликає однакове число мутацій як при одноразовому, так і при дробовому опроміненні невеликими порціями.
Хімічні мутагени екзогенного походження. Багато хімічні сполуки, що зустрічаються в навколишньому середовищі, мають здатність взаємодіяти з ДНК або з її низькомолекулярними попередниками і викликати мутації. При цьому одні хімічні сполуки спочатку є реакційноздатними мутагенами, безпосередньо з'єднуються з ДНК і змінюють її хімічну структуру, а інші, так звані промутагени. для перетворення в мутагени спочатку зазнають метаболічну активацію під дією ферментативних систем організму.
Одним з найбільш великих класів хімічних мутагенів екзогенного походження є алкілуючі агенти. під дією яких відбувається спонтанний (без участі ферментативних систем організму) перенесення алкільних груп цих хімічних сполук на біологічні макромолекули, в тому числі і ДНК. У табл. I.18 представлені основні класи алкилірующих агентів. У структурах хімічних сполук, наведених у таблиці, можна виявити відмінності за двома ознаками, роль яких в мутагенної активності алкилірующих агентів була неодноразово підтверджена експериментально. Одна з ознак відноситься до типу переносите алкільних груп: метильной, етільной або більш складною. Інший відмітна ознака - число алкільних груп, які віддає одна молекула алкилірующего агента. Це властивість називається функціональністю з'єднання. Так, серед азотистих іпритів H2 NCH2 CH2 Cl - монофункціонален, HN (CH2 CH2 Cl) 2 - біфункціонален, а N (CH2 CH2 Cl) 3 - тріфункціонален.
Головним джерелом мутацій, що виникають під дією алкилірующих агентів, є алкілування O-6 в гуанін і O-4 в тимін ДНК. Іншими сайтами, алкілування яких рідше призводить до мутацій, можуть бути N-3 гуаніну, N-1, N-3 і N-7 аденіну, N-3 цитозину, а також N-3 і N-4 тиміну. При цьому спектр мутацій, що виникають під дією будь-якого алкилірующего агента, як правило, специфічний. Слід зазначити, що завдяки функціонуванню репаративних систем клітини до виникнення мутацій призводить лише невелика частина алкілування ДНК. Тому частота реакцій між алкилирующим агентом і ДНК не пов'язана простою залежністю з їх мутагенною активністю. Те ж саме відноситься не тільки до алкилирующим агентам, а й до інших мутагенів.