Для створення безкисневих умов використовуються фізичні, хімічні та біологічні методи.
1) посів в глубінуплотних поживних середовищ (кров'яний або цукровий агар): а) посів уколом в високий стовпчик агару (анаероби виростають в глибині посіву); б) посів в трубках Віньяль-Вейона;
2) вирощування на спеціальних середовищах: на середовищі Кітт-Тароцці (рідка живильне середовище - 0,5% глюкоза, шматочки тканин тварин, наприклад, печінки, яка зв'язує кисень). Перед посівом середу кип'ятять і швидко охолоджують. Після посіву заливають шаром стерильного вазелінового масла.
в) вирощування в анаеростатах - спеціальну посудину, з якого вилучений кисень.
Анаеростатах - товстостінний металевий циліндр з добре притертою кришкою з гумовою прокладкою. У нього ставлять чашки Петрі (кришкою вгору) з посівами і видаляють повітря або витісняють інертним газом.
Хімічні методи - поглинання кисню повітря в герметично закритій посудині (апараті Арістовского) хімічними речовинами (такими як лужний пирогаллол або гідросульфіт натрію).
Біологічні методи (метод Фортнера) - спільне вирощування анаеробів і аеробів. Після посіву чашки Петрі герметично закривають пластиліном або парафіном. Спочатку в чашці Петрі розмножуються аероби, а коли весь кисень використовується, починають рости анаероби.
Виділення чистої культури аеробних і анаеробних бактерій.
Чистий культура мікроорганізмів - це популяція клітин (видимий зростання) одного виду. виросла на стерильній живильному середовищі.
Виділення чистої культури - бактеріологічний метод. Цей метод є основним методом діагностики бактеріальних інфекцій.
Для отримання чистої культури необхідно відокремити бактеріальні клітини різних видів один від одного. Найчастіше використовуються механічні способи відділення клітин - спеціальні методи посіву:
а) посів шпателем по Дрігальского в три чашки Петрі; на третій чашці виростають окремі колонії; кожна колонія - один вид, тому що колонія - потомство однієї клітини;
б) посів петлею "штрихами" або "сіткою": роблять посів переривчастими штрихами; в тому місці, де на агар потрапила велика кількість мікробних клітин, зростання буде в вигляді суцільного штриха, а на штрихах з невеликою кількістю клітин виростуть окремі колонії;
Таким чином, за допомогою спеціальних методів посіву отримують ізольовані колонії різних видів бактерій.
Виділення чистої культури проводять в три етапи:
Перший етап (1-ий день):
а) з матеріалу (суміш бактерій різних видів) готують мазок. забарвлюють по Граму і проводять мікроскопію;
б) роблять посів матеріалу (суміші бактерій) на чашку Петрі з МПА штриховим методом або за методом Дрігальского і ставлять в термостат при 37 ° С на 24-48 годин.
Другий етап (2-ий день):
а) спостерігають посіви і проводять опис колоній різних видів (розмір, форма, колір, поверхня, форма краю, структура, консистенція);
б) з колоній готують мазки і фарбують по Граму (колонія повинна містити один вид бактерій);
в) роблять пересів різних колоній в різні пробірки зі скошеним МПА для накопичення чистої культури; вирощують в термостаті при 37 ° С 24 години.
Третій етап (3-ий день): проробляють роботу по ідентифікації (визначення виду) культури і перевіряють чистоту культури. Для визначення виду вивчають морфологічні, культуральні, тинкторіальних і біохімічні властивості:
а) відзначають характер росту виділеної чистої культури на МПА (візуально вона характеризується однорідним зростанням);
б) готують мазок. забарвлюють по Граму і проводять мікроскопію; якщо культура чиста, то виявляють однакові морфологічні і тинкторіальних клітини;
в) роблять посів на середовища Гіссен і МПБ для вивчення сахаролитических і протеолітичних властивостей чистої культури; залишають в термостаті при 37 ° С на 24 години.
За сукупністю морфологічних, тинкторіальних, культуральних і біохімічних властивостей роблять висновок про видову приналежність виділеної чистої культури бактерій. При необхідності вивчають і інші ознаки (фактори вірулентності, антигенну структуру, чутливість до фагів і ін.).
В бактеріологічній практиці встановлення виду збудника дозволяє поставити діагноз захворювання, тому виділення і ідентифікація чистої культури - це і естьбактеріологіческій метод діагностики інфекційних захворювань. Постановка цього методу обов'язково включає і визначення чутливості виділеної чистої культури збудника до антибіотиків (визначення антибіотикограми).
Виділення чистої культури анаеробних бактерій також здійснюється в три етапи. При цьому також отримують чисту культуру з однієї клітини і домагаються зростання мікроорганізмів у вигляді ізольованих колоній з подальшим її пересівом і ідентифікацією.
Особливістю роботи по виділенню чистої культури анаеробів є застосування різних методів створення безкисневих умов (див. Вище).
Перший день. Роблять посів (земля, гній) на середу Кітт-Тароцці.
Другий день. для отримання колоній роблять пересів з середи Китта-Тароцці за методом Цейсслера, методу Вейнберга і методу Перетца.
Третій день. колонії пересівають в пробірку з новим середовищем Кітт-Тароцці для накопичення чистої культури; проводять ідентифікацію чистої культури анаеробів за морфологічними, культуральними, тинкторіальними, біохімічними та антигенними властивостями.
Посів за методом Цейсслера. Краплю (петлю) матеріалу з середи Китта-Тароцці послідовно засівають в три чашки Петрі з кров'яним агаром. Посіви ставлять в анаеростатах або апарат Арістовского, які ставлять в термостат. На наступний день на третій чашці виростають окремі колонії. Роблять пересівши цих колоній на середу Кітт-Тароцці для накопичення чистої культури, вивчення її властивостей і точного визначення виду мікроорганізмів.
Посів за методом Вейнберга. Пастерівської піпеткою переносять матеріал з середи Китта-Тароцці послідовно в 3-5 вузьких пробірок з цукровим МПА, занурюючи піпетку в розплавлений агар до самого дна пробірки. Пробірки швидко охолоджують під холодною водою. Агар застигає і роз'єднує мікробні клітини в глибині агару. З цих клітин виростають колонії, які пересівають в нове середовище Кітт-Тароцці, накопичують чисту культуру і ідентифікують.