При гострих ентеровірусних інфекціях діагностика заснована перш за все на результатах ізоляції вірусу з змивів глотки, прямої кишки, з рідин організму або різних тканин, з фекалій. За винятком дітей раннього віку, в момент появи клінічних симптомів вирусемия практично не піддається виявленню. При ураженні центральної нервової системи в 10-85% випадків посіви спинномозкової рідини, взяті в гострій фазі захворювання, можуть бути позитивними (за винятком поліовірусной інфекції, при якій виділити вірус із спинномозкової рідини вдається лише в рідкісних випадках). Частота виділення вірусу залежить від стадії захворювання і серотипу вірусу. Безпосередня ізоляція вірусу з ураженої тканини або рідини організму, що знаходиться в закритому просторі (наприклад, плевральна, перикардіальна або спинномозкова), зазвичай підтверджує діагноз. Виділення ентеровірусу з ротоглотки вказує на етіологічний зв'язок його з захворюванням, так як виявити тут вірус можна тільки в період часу тривалістю від 2 днів до 2 тижнів з моменту впровадження патогенного агента. Ізоляція вірусу з препаратів фекалій повинна інтерпретуватися з обережністю, так як безсимптомне виділення вірусу в зовнішнє середовище з товстого кишечника може тривати протягом 4 міс.
Крім того, діагноз може бути підтверджений чотириразовим або більше зміною титру нейтралізуючих антитіл при порівнянні парних препаратів сироватки, взятої в гострій фазі захворювання і в фазі одужання. Цей метод доріг і трудомісткий, вимагає ретельного відбору серотипів для використання в якості антигенів. Тому серодіагностики застосовують в критичних ситуаціях, коли вірус можна виділити тільки з периферичних джерел (наприклад, з фекалій), або в разі захворювань (наприклад, миоперикардит), при яких рутинне взяття посівів малоинформативно, а число серотипів, здатних викликати захворювання, обмежена. Кількісна інтерпретація титру антитіл при одноразовому дослідженні сироватки нерідко буває доцільна при постановці діагнозу, так як навіть у здорової людини можуть зустрічатися антитіла до різних серотипам вірусу, а титри їх можуть коливатися в широких межах. При гострій поліовірусной інфекції певну допомогу при діагностиці може надати визначення титру антитіл в гострій фазі захворювання і в періоді одужання.
Величини таких показників, як лейкоцитоз і швидкість осідання еритроцитів, лише незначно збільшені. При некрозі (наприклад, печінки, легенів) відзначають нейтрофільних реакцію. У хворих з гепатитом виявляють гипербилирубинемию і підвищення активності трансаміназ і лужних фосфатаз. Часто виникає транзиторна альбумінурія; гематурія спостерігається рідко.