Імуноглобуліни - це глікопротеїди, секретуються плазматичними клітинами. Вироблення антитіл відбувається, як правило, після антигенної стимуляції. Більшість антигенів викликають одночасну стимуляцію декількох клонів B-лімфоцитів - поліклональна стимуляція. Антитіла, що виробляються одним клоном B-лімфоцитів, - моноклональні антитіла - повністю ідентичні. Між антитілами, які виробляються різними клонами B-лімфоцитів, завжди є якісь відмінності, наприклад в будові ділянки зв'язування з антигеном або силі зв'язування з антигеном. Відомі 5 класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. В основі будови молекули імуноглобуліну будь-якого класу лежить Y-образна структура, що складається з 2 важких і 2 легких ланцюгів, з'єднаних дисульфідними містками (див. Гл. 1, п. IV.А.4). «Гілки» молекули (Fab-фрагмент) служать для зв'язування антигену, а «стовбур» (Fc-фрагмент) виконує інші біологічні функції: активує комплемент, зв'язується з клітинною мембраною і т. Д. IgG присутні в біологічних рідинах у вигляді мономерів. Вони складають більшу частину імуноглобулінів сироватки і є основним класом імуноглобулінів, що виробляються при вторинному імунній відповіді. IgE, також мономерні, беруть участь в алергічних реакціях негайного типу. IgD знаходяться в основному на мембранах B-лімфоцитів і виконують роль антігенраспознающіх рецепторів, в сироватці присутні в незначній кількості у вигляді мономерів. IgA містяться в сироватці переважно в вигляді мономерів, в секреті слизових і молозиві - у вигляді димерів, що містять також J-ланцюг і секреторний компонент, який синтезується в епітелії слизових. Дімерная IgA з'єднується з секреторним компонентом, проходячи через епітелій на поверхню слизової. IgM присутні в сироватці переважно в вигляді пентамер. Вони складають основну частку імуноглобулінів, що виробляються при первинному імунній відповіді. Методи дослідження імуноглобулінів включають в себе визначення рівня імуноглобулінів різних класів і підкласів і антитіл до певних антигенів. При оцінці результатів дослідження необхідно враховувати, що рівень імуноглобулінів залежить від віку (див. Додатки IV та V). Зміна рівня імуноглобулінів в сироватці може бути наслідком порушення їх синтезу, катаболізму або виведення.
2. Іммуноелектрофорез. Суть методу полягає в наступному: 1) проводять електрофоретичної поділ білків в гелі; 2) після закінчення електрофорезу в гелі паралельно напрямку електрофорезу вирізують борозенки; 3) в борозенки вносять антитіла (антисироватки), наприклад до тяжких (альфа, дельта, епсилон, гама, мю) або легким (лямбда, каппа) ланцюгах імуноглобулінів. Ці антитіла і розділені при електрофорезі білки дифундують назустріч один одному. У тих місцях, де антитіла зв'язуються з білками, утворюються дуги преципітації (див. Рис. 20.2). Іммуноелектрофорез дозволяє оцінити лише якісний склад досліджуваної суміші білків. Оцінка результатів дослідження вимагає високої кваліфікації. Найчастіше цей метод застосовується для виявлення і характеристики моноклональних антитіл.
3. Електрофорез з іммунофіксаціей. Цей метод заснований на електрофоретичному поділі білків сироватки в гелі з наступною інкубацією гелю в присутності антитіл до тяжких і легких ланцюгів імуноглобулінів. При зв'язуванні білків з антитілами утворюються імунні комплекси, які можна побачити після фарбування (див. Рис. 20.3). Імунні комплекси, що містять нормальні імуноглобуліни, відкладаються у вигляді широкої, розмитою смуги, моноклональні - у вигляді більш вузькою і чітко окресленої. Цей метод також є якісним, однак більш чутливий і простий, ніж іммуноелектрофорез. Електрофорез з іммунофіксаціей часто застосовується в поєднанні з іммуноелектрофореза для визначення моноклональних або олігоклональних імуноглобулінів.
Б. Подвійна радіальна іммунодіффузія - Напівкількісний метод, за допомогою якого можна не тільки виявити антигени, але і оцінити ступінь подібності між ними. Суть методу полягає в наступному: 1) в лунки, вирізані в агарі, вносять досліджувану суміш антигенів і антитіла з відомою специфічністю (зазвичай в центральну лунку вносять антитіла, а в розташовані навколо неї - антигени); 2) антигени і антитіла дифундують у напрямку один до одного; 3) в тому місці, де відбулося зв'язування антитіл і антигенів, утворюються смуги преципітації. За взаємним розташуванням і формою смуг преципітації можна оцінити ступінь подібності між антигенами, що знаходяться в сусідніх лунках. В даний час цей метод застосовується в діагностиці аутоімунних захворювань для виявлення аутоантитіл до екстрагуються ядерних антигенів (див. Гл. 15, п. II.Д.2). Хоча по чутливості метод подвійної радіальної імунодифузії поступається багатьом кількісних методів, технічно він простий, не вимагає високоочищених антитіл, специфічний і може використовуватися при проведенні масових досліджень.
Г. Нефелометрія - визначення концентрації зважених часток і високомолекулярних речовин в розчині, засноване на оцінці інтенсивності розсіювання світла, що проходить через цей розчин. Нефелометрія може бути використана для визначення концентрації антигенів, оскільки при додаванні до них антитіл утворюються імунні комплекси, що розсіюють проходить світло. Нефелометрія дозволяє з високою точністю визначити концентрацію IgG, IgA, IgM, підкласів IgG, C3, C4, фактора B, C-реактивного білка і деяких інших сироваткових білків. Цей метод підходить для визначення білків в низькій концентрації, наприклад IgE, рівень якого в сироватці не перевищує 1 мкг / мл. В даний час багато лабораторій використовують нефелометрія в якості стандартного методу кількісного визначення імуноглобулінів.
Е. Твердофазний ІФА. В якості твердої фази найчастіше використовуються полістиролові планшети з сорбованих на них антигенами або антитілами. Визначення антитіл до якого-небудь антигену проводять наступним чином: 1) досліджувану рідину вносять в лунки планшета з сорбованих на них антигеном; 2) під час інкубації антитіла зв'язуються з антигеном; 3) планшет відмивають від незв'язаних антитіл і додають антитіла до імуноглобулінів (другі антитіла), мічені ферментом; 4) планшет знову відмивають, додають субстрат ферменту і хромоген (речовина, що міняє забарвлення в процесі хімічної реакції); 5) під дією продукту ферментативної реакції хромоген змінює забарвлення. Чим більше мічених ферментом друге антитіл зв'язується з комплексами антиген-антитіло, тим вище активність ферменту і інтенсивність забарвлення розчину (див. Рис. 20.5). Концентрацію антитіл в пробі визначають спектрофотометрично - по оптичної щільності пофарбованого розчину. Такий же підхід застосовується для визначення антигену в пробі. В цьому випадку використовуються планшети з сорбованих антитілами до досліджуваного антигену, мічені ферментом другі антитіла також спрямовані до цього антигену (див. Рис. 20.5). Твердофазних ІФА застосовують для кількісної оцінки антитіл і антигенів. За чутливості який можна порівняти з РІА, але більш простий, дешевий і не вимагає застосування радіоактивних ізотопів. Багато лабораторій використовують твердофазний ІФА в якості стандартного методу визначення противірусних антитіл, включаючи антитіла до ВІЛ, цитокінів і імуноглобулінів (IgE і підкласів IgG).
Ж. Імуноблотинг - якісний метод, що дозволяє виявляти антигени і антитіла в досліджуваній пробі. Антитіла за допомогою цього методу виявляють наступним чином: 1) суміш відомих антигенів поділяють за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі і переносять на нітроцелюлозну мембрану; 2) мембрану инкубируют з досліджуваної пробою, наприклад сироваткою, а потім - з міченими антитілами до імуноглобулінів. Для виявлення антигенів електрофоретичного розділення піддаються білки досліджуваної проби, які потім переносяться на мембрану з подальшим додаванням мічених антитіл до відомим антигенів. В даний час випускаються готові набори для проведення иммуноблоттинга. Цей метод широко застосовується для підтвердження результатів твердофазного ІФА при діагностиці ВІЛ-інфекції.
З. Інші методи дослідження
1. Непряма імунофлюоресценція - метод, за допомогою якого можна виявити антитіла до відомим антигенів. Як джерело антигену зазвичай використовують зрізи тканин або культури клітин. Субстрат, перенесений на предметне скло, інкубують в присутності досліджуваної проби, наприклад сироватки, а потім - в присутності мічених флюорохромом антитіл до імуноглобулінів. Пов'язані з субстратом антитіла виявляють за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Цей метод зазвичай застосовується для виявлення антинуклеарних антитіл і антитіл до деяких вірусів. Хоча метод не є кількісним, він досить чутливий і простий.
2. Методи, засновані на реакції аглютинації. Для реакції аглютинації зазвичай використовують еритроцити (гемагглютинация) або частки латексу (латекс-аглютинація), покриті відомим антигеном. У присутності антитіл до цього антигену відбувається аглютинація еритроцитів або частинок латексу. Гемаглютинація застосовується для виявлення антитіл до тиреоглобуліну і мікросомальних антигенів, латекс-аглютинація - для виявлення ревматоїдного фактора і деяких інших антитіл. Ці методи прості і дозволяють кількісно визначити антиген, проте менш чутливі, ніж РІА і твердофазного ІФА.