Клонування генів - це процедура, що включає виділення і ампліфікацію окремих генів в реципієнтних клітинах, про- і еукаріотичних. Ці клітини, що містять потрібний ген, можна використовувати для отримання: а) великої кількості білка, кодованого даним геном; б) великої кількості самого гена в високоочищеним вигляді.
Процес клонування генів включає в себе кілька стадій:
1. Отримання необхідного гена:
а) шляхом розщеплення геномної ДНК за допомогою рестриктаз (ендонуклеази, що розщеплюють молекулу ДНК в строго визначеному місці);
б) шляхом хімічного синтезу тільки невеликих фрагментів ДНК (так як знаючи послідовність амінокислотних залишків в білкової молекулі, можна завжди визначити послідовність нуклеотидів в фрагменті ДНК, що кодує даний білок, відповідно до генетичним кодом). Так, шляхом хімічного синтезу було отримано ген, відповідальний за синтез соматостатину;
в) з клітин організму виділяють молекули іРНК і за допомогою ферменту зворотної транскриптази (РНК-залежна ДНК-по-лімераза) знімають ДНК-копії необхідного гена. Наприклад, з острівних клітин підшлункової залози були виділені іРНК, що несуть інформацію про синтез інсуліну. А з клітин, інфікованих вірусами, виділені і РНК, що несуть інформацію про синтез інтерферону.
2. Введення виділеного або отриманого фрагмента ДНК до складу векторної молекули ДНК - отримання рекомбінантних ДНК. Вектор - це щось на зразок молекулярного «таксі», здатного переносити чужу ДНК всередину бактеріальної клітини таким чином, щоб вона могла там реплицироваться. Існує два основних типи векторів: бактеріальні плазміди (частіше відповідальні за стійкість до двох і більше антибіотиків) і помірні дефектні (здатні до здійснення трансдукції) бактеріофаги.
Плазміду розщеплюють за допомогою рестриктаз в сторо певному місці. Після розщеплення її кінці, як і кінці виділеної для клонування ДНК, за допомогою кінцевий трансферази «дорощують» так, щоб кінцеві ділянки плазміди були комплементарні вбудовується ДНК (або ще кажуть «липкими»). Далі, завдяки взаємодії «липких» послідовностей і за допомогою спеціальних ферментів ДНК-лігази здійснюють зшивання (лігування) ДНК-вставки і плазмідної ДНК. Отримана в результаті нова кільцева молекула ДНК називається вже рекомбінантної ДНК.
3. Введення рекомбінантної ДНК до складу клітини-реципієнта. Клітини, вибрані для клонування генів можуть бути як про-, так і еукаріотичних. Найчастіше для цієї мети використовують бактерії, оскільки їх культивування не представляє великої проблеми (E. coli, В. subtilis і ін.). Але якщо ген виділено за методикою 1, то його необхідно клонувати в клітинах еукаріотів, наприклад, дріжджів. Введення рекомбінантної ДНК здійснюють шляхом трансформації (проникність клітинної стінки бактерій збільшується в розбавленому розчині хлористого кальцію) або трансдукції (в разі використання в якості вектора бактеріофага).
4. Відбір трансформованих бактерій. Оскільки не всі бактеріальні клітини в реакційній суміші будуть трансформовані, необхідно провести відбір клітин, що містять рекомбінантні бактерії. Відбір зазвичай заснований на тому, що плазміди забезпечують резистентність до тих чи інших антибіотиків, а отже, бактерії, що містять плазміди, будуть розмножуватися в присутності відповідного антибіотика.
5. Культивування трансформованих клітин. Культивування відібраних клітин необхідно для нарощування біомаси з метою ампліфікації генів в клітинах-реципієнтах.
6. Виділення білкового продукту гена або виділення вбудованої ДНК з очищених плазмід.
Отримання моноклональних антитіл (МКА)
Основні методи сучасної клітинної інженерії - гібридизація (або Фузія) і реконструкція клітин. Метод гібридизації клітин дозволяє з'єднати воєдино клітини навіть абсолютно різних мікроорганізмів, а також клітини рослин, тварин і людини.
Фузія клітин здійснюється або обробкою клітин поліетиленгліколем, або дією коротких електричних імпульсів. Отримані в результаті гібридні клітини - гібридоми - мають два набори хромосом і поєднують в собі властивості обох «батьківських» клітин.
У 1974 р Мілстайн і Келлер здійснили гібридизацію нормальних лімфоцитів з селезінки імунізованих миші з мієломний клітинами миші. Продукт злиття антителопродуцирующих клітин з пухлинними - Гібридома, що продукує антитіла однієї специфічності (до однієї антигенної детермінанті) і здатна до необмеженого росту in vitro.
МКА широко використовуються для діагностики багатьох бактеріальних і вірусних інфекцій (гепатит В, грип, герпес, бруцельоз); визначення тканинних антигенів, рецепторів і медіаторів лімфоцитів; для діагностики та лікування злоякісних пухлин (створені МКА, що реагують із специфічними Аг раку легенів, молочної залози, товстої кишки, підшлункової залози).
Теми доповідей для навчальної конференції
1. Історія розвитку біотехнології.
2. Біотехнологія і дозвіл екологічних проблем.
3. Біотехнологія: нові можливості в діагностиці та лікуванні.
4. Нові лікувальні препарати.
5. Можливості і перспективи генної інженерії.