Глікоген локалізується в цитоплазмі клітин і відіграє важливу роль в енергетичному метаболізмі клітин. При цитохімічним дослідженні глікогену використовують головним чином PAS-реакцію або ШИК-реакцію (за назвою реактивів - Шифф-йодна кислота).
метод Шабадаша
Під впливом перйодатом глікоген окислюється з утворенням альдегідних сполук, легко реагують з реактивом Шиффа (фуксин-сірчиста кислота). У місцях локалізації глікогену виявляється вишнево-фіолетове забарвлення, за інтенсивністю якого можна судити про кількість глікогену в клітинах.
Посуд і устаткування
- Хімічні склянки ємністю 50 мл або кювети.
- Мірні циліндри.
- Градуйовані піпетки.
- Колби ємністю 250 мл.
- Воронки.
- Пальники.
- Термостат.
- Ваги.
- 0,03 М розчин перйодатом або натрію: 230 мг перйодати розчиняють в 100 мл дистильованої води. Готують перед вживанням.
- Реактив Шиффа: 1 г основного фуксину розчиняють в 200 мл киплячої дистильованої води. У міру охолодження в розчин додають 1 г метабісульфіту калію і 20 мл 1 н. розчину соляної кислоти. Залишають на добу. Для повного знебарвлення додають растолченную таблетку карболену, залишають на добу, потім фільтрують. Реактив зберігають у темряві (краще на холоді) в щільно закритому посуді. Придатний до вживання протягом декількох місяців (легка ступінь почервоніння свідчить про непридатність реактиву).
- Сірчиста вода: до 10 мл 10% розчину метабісульфіту калію додають 200 мл дистильованої води і 10 мл 1 н. розчину соляної кислоти. Готують перед вживанням.
- Реактив Шабадаша: до 100 мл етилового спирту додають 1,8 г нітрату міді, 0,9 г нітрату кальцію і 10 мл формаліну.
- 1 н. розчин соляної кислоти (82,5 мл концентрованої соляної кислоти питомої ваги 1,19 доливають дистильованою водою до 1 л).
- 0,1% спиртовий розчин світло-зеленої фарби (ліхтгрюн).
хід забарвлення
- Препарати фіксують (негайно після приготування) в рідини Шабадаша протягом 30 хв.
- Промивають у двох змінах дистильованої води.
- Занурюють в розчин перйодати на 20 хв (в темряві).
- Промивають у трьох змінах дистильованої води.
- Обполіскують в сірчистої воді (протягом 1 - 2 хв).
- Фарбують реактивом Шиффа протягом 30 - 40 хв (в темряві).
- Промивають у трьох змінах сірчистої води по 3 хв.
- Промивають у трьох змінах дистильованої води по 3 хв.
- Фарбують світло-зеленою фарбою протягом 10-20 с.
- Промивають в дистильованої воді.
Для проведення реакції зручно все розчини помістити в хімічні стаканчики або кювети і переносити препарати у зазначеній вище послідовності.
В даний час існують реагенти для цитохимического дослідження на глікоген заводського виробництва, які простіші в застосуванні. На жаль, не всі з них володіють гарною якістю.
Результат методу Шабадаша
Глікоген забарвлюється в вишнево-фіолетовий колір на зеленому тлі препарату.
Розрахунок кількості глікогену виробляють по напівкількісним методу або висловлюють у відсотках.
Крім глікогену, позитивну реакцію можуть давати такі ШИК-позитивні речовини, як кислі і нейтральні мукополісахариди, мукопротеіни, глікопротеїни та ін. Глікоген легко диференціювати від інших речовин пробою зі слиною чи діастазою.
Проба зі слиною
Препарат поміщають в свежесобранную слину і залишають на 30 хв в термостаті. Потім проводять забарвлення на глікоген наведеним вище методом. Інкубація препаратів зі слиною сприяє розщепленню глікогену, і при реакції з реактивом Шиффа не виходить рожевого забарвлення.
Ідентифікувати глікоген можна також шляхом попередньої інкубації мазків з амілазою (1 мл профільтрованої амілази розчинити в 40 мл фізіологічного розчину) протягом 30 хв в термостаті.
На практиці проба зі слиною зазвичай не проводиться, тому під PAS-позитивних матеріалом розуміються, як правило, все полісахариди, а не тільки глікоген.
Нормальні величини методу Шабадаша
У мазках периферичної крові глікоген міститься в цитоплазмі нейтрофілів (у вигляді рясної дрібної зернистості), цитоплазмі лімфоцитів (у вигляді невеликої кількості великих зерен) і тромбоцитах (у вигляді одиночних великих зерен). В пунктаті кісткового мозку глікоген виявляється в нейтрофілах різного ступеня зрілості, лімфоцитах і мегакаріоцитів.
У зрілих еозинофілів і базофілів PAS-позитивний матеріал розташовується в такий спосіб: специфічні гранули залишаються незабарвленими і різко виділяються на тлі дифузного фарбування цитоплазми.
У моноцитах глікоген частіше виявляється у вигляді дрібної пилоподібної зернистості на тлі світло-рожевого дифузного фарбування.
У нормі від 3 до 10% клітин еритроїдного ряду містять мукополісахариди.
У мегакаріоцитів кісткового мозку глікоген виявляється у вигляді гранул (від одиничних до 30-50), нагадуючи скупчення кров'яних пластинок. У здорових людей число глікогенположітельних мегакариоцитов становить 58,45 - 65,55%. У тромбоцитах PAS-позитивний матеріал виявляється у вигляді дрібних розсіяних гранул по периферії клітини або у вигляді інтенсивного центрально розташованого плями.
Клінічне значення методу Шабадаша
Збільшення вмісту глікогену в нейтрофілах спостерігається при різних запальних процесах, еритреми, цукровому діабеті, зменшення - при агранулоцитоз, променевої хвороби, хронічному мієлолейкозі, особливо при прогресуванні процесу.
Підвищення числа глікогенположітельних лімфоцитів (до 70 - 80%) характерно для лімфопроліферативних захворювань, особливо хронічного лімфолейкозу.
При тромбоцитопенічна пурпура та симптоматичних тромбоцитопеніях число глікогенположітельних форм мегакаріоцитів значно знижено, після спленектомії воно підвищується до нормальних величин.
При гострих лейкозах глікоген можна виявити в бластних клітинах: при гострому мієлобластний лейкоз у вигляді дрібної зернистості в цитоплазмі або у вигляді слабкого дифузного її фарбування, причому в частині бластів PAS-реакція негативна. При гострому промієлоцитарному лейкозі спостерігається яскраве дифузне фарбування цитоплазми. У монобластов реакція може бути негативною, слабо позитивної в дифузійної або дифузно-гранулярной формі (коли продукт реакції виявляється у вигляді розсіяних дрібних або середніх гранул, розташованих по краю цитоплазми, на дифузному тлі). При еритромієлоз глікоген у вигляді гранул виявляється в еритробластах, у вигляді дифузного фарбування різної інтенсивності - в нормобластов. Лімфобласти містять глікоген в цитоплазмі у вигляді середніх і великих гранул, розташованих віночком навколо ядра, що іноді зливаються в блоки, на незабарвленому тлі. Кількість клітин з таким характером PAS-реакції сильно варіює при різних випадках гострого лімфобластного лейкозу.
Цитохимические дослідження на глікоген можна проводити не тільки в мазках крові і кісткового мозку. Так, наприклад, можна досліджувати мазки вагінального епітелію і за результатами дослідження судити про функціональний стан яєчників. У нормі у жінок виявляють багато глікогену в клітинах, в той час як збіднення їх гликогеном свідчить про порушення функції яєчників.
У пухлинах кількість глікогену різному: зрілі доброякісні пухлини містять багато глікогену, в незрілих ракових пухлинах кількість глікогену різко зменшено. Зниження глікогену в пухлинних клітинах, ймовірно, може бути використано як показник злоякісності пухлини.
Мікрофотографії ШИК-реакції:
література:
Цитохимические дослідження мієлопероксидази
Мієлопероксидази є лізосомальніферменти, що каталізує у присутності перекису водню окислення різних субстратів. Вона локалізується переважно в специфічних азурофільних гранулах в цитоплазмі гранулоцитів і є маркером клітин мієлоїдного ряду. Мієлопероксидази виявляється в клітинах гранулоцитарного ряду, починаючи з мієлобласти.
Цитохимические дослідження ліпідів
Цитохимические дослідження ліпідів засноване на застосуванні барвників, що розчиняються в жирах (судан III, судан IV, чорний судан і ін.). Для виявлення нейтрального жиру користуються Суданом III, забарвлює жир в помаранчевий колір. Ліпоїдами виявляються краще Суданом чорним (чорне забарвлення).
Кільцева проба Геллера
Кільцева проба Геллера відноситься до якісних реакцій визначення білка в сечі. Так як вона заснована на реакції коагуляції, то досліджувана сеча повинна відповідати певним вимогам: бути прозорою і мати кислу реакцію.
підрахунок миелокариоцитов
Для підрахунку миелокариоцитов пунктат кісткового мозку розводять в 200 разів. Для цього до 4 мл 3 -5% розчину оцтової кислоти додають 0,02 мл пунктату. Вміст пробірки ретельно перемішують і заповнюють камеру Горяєва. Після осідання формених елементів (через 1 - 2 хв) підраховують міелокаріоцітов в 100 великих квадратах (аналогічно підрахунку числа лейкоцитів в периферичної крові).
Морфологія клітин мегакариоцитарного паростка
Мегакаріобласти - родоначальні клітини мегакариоцитарного ряду. Розмір - близько 20 мкм. Ядро кругле, з мелкосетчатой структурою хроматину, іноді сплетеного у вигляді клубка. Структура ядра грубіше, ніж у недиференційованого Бласта, нерідко видно ядерця. Цитоплазма базофильная, беззерністая, має вигляд вузького обідка. Часто контури клітин нерівні, з відростками цитоплазми і освітою "блакитних" платівок.