Структура і функції нуклеїнових кислот
Нуклеїнові кислоти - природні високомолекулярні полінуклеотіди, що забезпечують зберігання, передачу і реалізацію спадкової інформації. Вперше вони були описані в 1869 р швейцарським біохіміком Фрідріхом Мішер (1844-1895). З ядер лейкоцитів, що містяться в гної, він виділив органічна речовина, до складу якого входять азот і фосфор. Вчений назвав цю речовину нуклєїнах (від лат. «Nucleus» - ядро), вважаючи, що воно міститься лише в ядрах клітин. Пізніше небілкова частина цієї речовини була названа нуклеїнової кислотою; її кислотні властивості обумовлені присутністю в складі молекули залишків фосфорної кислоти.
Мономерами нуклеїнових кислот є нуклеотиди. Вони складаються із залишків фосфорної кислоти, азотистого підстави і цукру - пентози (рибози або дезоксирибози). Дезоксирибоза відрізняється від араб тим, що з 2-м атомом вуглецю в ній пов'язаний атом водню, а не гідроксильна група, як у рибози.
Залишок азотистого підстави в молекулі нуклеотиду пов'язаний з першим атомом вуглецю пентози, а залишок фосфорної кислоти - з п'ятим атомом вуглецю. При частковому гідролізі від нуклеотидів відщеплюється залишок фосфорної кислоти, і утворюються нуклеозиди. що складаються з азотистої основи і залишку моносахарида - рибози або дезоксирибози.
Азотисті основи нуклеотидів нуклеїнових кислот представлені похідними пурину - аденін (А) і гуаніном (Г), пиримидина - тиміном (Т), цитозином (Ц) і урацілом (У).
Залежно від типу азотистого підстави розрізняють пуринові і пірамідіновие нуклеотиди. Назва нуклеотид визначається видом азотистого підстави і пентози, що входять до його складу. Наприклад, аденіловий рибонуклеотид, тіміділових дезоксірібонуклеотідов і т.п.
Існує два типи нуклеїнових кислот, що розрізняються за складом, будовою і функціями. Одна з них містить вуглеводний компонент - дезоксирибози і називається дезоксирибонуклеїнової кислотою (ДНК).
Інша містить рибозу і називається рибонуклеїнової кислоти (РНК). Обидва типи нуклеїнових кислот являють собою полімерні молекули, мономерами яких служать нуклеотиди. Мономери пов'язані між собою ковалентними фосфодіефірнимі зв'язками, що з'єднують 5-й атом вуглецю пентози одного нуклеотиду з 3-м атомом вуглецю пентози сусіднього нуклеотиду. При цьому на одному кінці полінуклеотидних ланцюга розташовується мономер, що містить залишок фосфорної кислоти (його називають 5 'кінець), а на іншому кінці - мономер, що містить неетеріфіцірованних 3'-гідроксильну групу (3' - кінець).
Таким чином, нуклеїнові кислоти - це найважливіші біополімери, що визначають основні властивості живого.
1.Строеніе і функції ДНК
ДНК є головним носієм спадкової інформації.
ДНК входить до складу:
1. Хромосом вірусів і бактерій
2. позахромосомних (цитоплазматичних) генетичних структур прокаріотів (плазміди бактерій)
3. Хромосом еукаріот
4. Транспозіруемих (мігруючих) генетичних елементів (вставні послідовності і транспозони бактерій, мобільні дисперговані елементи і сателітна ДНК еукаріот).
Локалізація ДНК в клітині:
1) в прокариотической - цитоплазма;
2) в еукаріотичної - ядро, органели (мітохондрії, пластиди, клітинний центр).
Первинна структура ДНК - це лінійно розташована послідовність нуклеотидів в полінуклеотидних ланцюга. Нуклеотиди пов'язані між собою фосфодіефірнимі зв'язками. Характеризується первинна структура кількістю нуклеотидів, порядком їх розташування і типами азотистих основ, що входять до складу нуклеотидів.
Вторинна структура ДНК - це подвійна спіраль, утворена двома полінуклеотидні, антипаралельними ланцюгами, з'єднаними водневими зв'язками між комплементарними азотистими підставами. Комплементарність (взаємне відповідність) визначається здатністю азотистих основ утворювати однакову кількість водневих зв'язків. А - Т; Г Ц.
Склад нуклеотидів ДНК підпорядковується правилам Е. Чаргаффа:
1) сума нуклеотидів, що містять пуринові азотисті основи, дорівнює сумі піримідинових азотистих основ, тобто
3) для кожної молекули і сукупності молекул в клітині організму певного виду специфічно співвідношення
коефіцієнт видової специфічності.
Найбільш поширена форма спіралі - По-форма. У біологічному сенсі По-форма найбільш адекватна для Реплікаційний процесів, А-форма - для процесу транскрипції, С- форма - для упаковки ДНК у складі надмолекулярних структур хроматину і деяких вірусів. Z-форма бере участь в кроссинговере.
Таким чином, вторинна структура молекул ДНК, мабуть, пов'язана із здійсненням інформаційних процесів у живій природі, а саме: А-форма ДНК - з передачею інформації від ДНК до РНК, В-форма - з множенням кількості інформації, С-форма - з зберіганням інформації.
Третинна структура ДНК - це просторова конфігурація молекули; ДНК може перебувати в лінійною або кільцевою формою. Кожна з цих форм характеризується спирализация і супер- (понад) спирализация.
Четверта структура ДНК - це ДНК в комплексі з білками.
Денатурація і ренатурації ДНК
Водневі зв'язки між комплементарними підставами можуть бути розірвані (при підвищенні температури, додаванні спирту та ін.); в результаті цього розриву утворюються однонітевиє ДНК. Даний процес називається денатурацією (плавлення). Зворотний процес відновлення подвійної спіралі - ренатурацією. Температура плавлення збільшується при збільшенні частки Г-Ц пар; для ДНК ссавців, що мають в середньому близько 40% Г-Ц пар, температура плавлення становить 85-90 ° С.
Біологічне значення ДНК полягає в тому, що вона є носієм спадкової інформації, що забезпечує спадкоємність життя в ряду поколінь. На основі програми, закладеної в молекулах ДНК, здійснюється синтез білків, що забезпечують всі процеси життєдіяльності клітини.
1.2. Будова і функції РНК
Основна роль РНК складається в трансляції генетичної інформації з утворенням білків. Цей процес складається з декількох етапів, кожен з яких здійснюється різними РНК. У клітці існує кілька типів РНК: рибосомальні РНК (р-РНК), інформаційні, або матричні РНК (і-РНК, або м-РНК), транспортні РНК (т-РНК), малі ядерні РНК (ма-РНК), РНК затравки (праймери), гетерогенні ядерні РНК, або РНК - попередники (гя-РНК, або про-РНК), РНК вірусів і ін.
Рибосомальна РНК - одна з найбільших молекул РНК, містить від 3 тис. До 5 тис. Нуклеотидів. Синтезується в полісом. Потім вона, об'єднуючись з білками, утворює велику і малу субодиниці рибосом. У складі рибосом РНК виконує структурну функцію, а також бере участь в синтезі поліпептидів. На частку р-РНК припадає 85% всієї РНК клітини.
Матрична, або інформаційна, РНК - служить матрицею для синтезу поліпептиду під час трансляції. Міститься в ядрі, цитоплазмі, а також в мітохондріях і пластидах. Молекули м-РНК містять від 100-10000 нуклеотидів і мають лінійну структуру. На її частку припадає 5% загального вмісту РНК в клітині.
Транспортна РНК - має найбільш короткі ланцюги, що складаються з 70-100 нуклеотидів. Міститься в цитоплазмі клітин, в мітохондріях і пластидах. Все т-РНК внаслідок утворення водневих зв'язків між комплементарними азотистими підставами різних ділянок ланцюга, набувають вторинну структуру, в двомірному зображенні нагадує лист конюшини. У т-РНК два активних центру: аміноацільний на 3'-кінці і антикодон на антикодоновой петлі. Максимальне число т-РНК в клітині - 61, але звичайне їх кількість коливається від 20 до 40. Основна функція т-РНК складається в перенесенні амінокислот до місця синтезу білка в рибосомах. На частку РНК припадає приблизно 15% всієї РНК, що міститься в клітині.
Малі ядерні РНК - це короткі стабільні молекули РНК, більшість яких в складі нуклеопротеїдних частинок присутні в ядрі. Вони виявлені в складі сплайсосом ссавців. Ці РНК називають U-РНК через незвично великий вміст урацила і його модифікованих форм. Таким чином, основна функція ма-РНК - участь в сплайсинге.
Гетерогенна ядерна РНК - попередник зрілої РНК, локалізована в ядрі. Ці РНК містять оригінали транскрипт і мають таку ж довжину, як і гени, з яких вони скопійовані.
Вірусні РНК - виконують функцію генетичного матеріалу вірусів. На відміну від клітинних можуть бути двухцепочечную.
1.3. реплікація ДНК
Генетична програма клітинних організмів записана в нуклеотидної послідовності ДНК. Для збереження унікальних властивостей організму необхідне точне відтворення цієї послідовності в кожному наступному поколінні. Процес подвоєння молекул ДНК називається реплікацією.
В основі цього процесу лежать наступні принципи:
7) Гени, які контролюють процес реплікації.
Реплікація починається в специфічних ділянках - точках початку реплекаціі (ori - від англ. Origin). У цьому місці ланцюга розходяться, утворюючи реплікативні вилки. Реплікація йде в двох напрямках від кожної точки ori до тих пір, поки реплікативні вилки сусідніх репліконов не будуть прилягати.
Швидкість реплікації генома регулюється в основному частотою ініціюють подій. Наприклад, у E к.с. oli швидкість копіювання в кожній репликативной вилці дорівнює 1500 п.н. в секунду. Швидкість руху реплікативної вилки в клітині значно менше (10-100 п.н. в секунду).
1) ініціація (підготовка матриці, розплітання подвійної спіралі).
2) елонгація (процес синтезу дочірніх ланцюгів ДНК).
3) термінація (завершення синтезу дочірніх ланцюгів ДНК).
Основним ферментом синтезу ДНК є ДНК - полімераза. Особливість цього ферменти полягає в тому, що він веде синтез тільки в напрямку 5 '- 3' кінець, тобто йому потрібна запал, в якості якої виступає 3'кінець вже існуючого полинуклеотида.
ПРОЦЕС РЕПЛІКАЦІЇ У прокаріотів
Білки і ферменти, що беруть участь в реплікації:
1) Білки, які дізналися точку початку реплікації;
2) Фермент геліказа забезпечує розплітання подвійної спіралі шляхом розриву водневих зв'язків.
3) Ферменти топоізомерази - знімають суперпіралізацію перед репликативной виделкою.
4) SSB -белкі - стабілізують ДНК в одноланцюговий стані.
5) Фермент праймаза (РНК-полімераза) - синтезує РНК-затравки.
6) Ферменти ДНК-полімерази.
а) ДНК-полімеразаIII - основний фермент реплікації; здійснює елонгацію в напрямку 5 '- 3' від 3'-ОН-затравки.
Б) ДНК - полімеразаII - володіє дуже низькою полімеразної активністю; основною функцією є добудова пошкоджених ділянок в молекулі ДНК, тобто репарація ДНК. Погано з'єднується з одноланцюжковий ДНК, але відмінно окупує точки розриву в одному з ланцюжків ДНК.
В) ДНК-полімеразаI - допоміжний фермент, здійснює елонгацію в напрямку 5 '- 3' від 3'-ОН-затравки при застраіваніі проломів, володіє 3 '- 5' і 5 - 3 'екзонуклеазной активністю.
7) Фермент ДНК-лігаза - здійснює «зшивання» фрагментів Окадзакі.
8) ДНК гіраза - бере участь в закручуванні спіралі
Ініціація. Хромосома прокаріотів містить єдину область почала реплікації (ori C). У ori C є п'ять консенсусних девятінуклеотідних сайтів зв'язування инициаторного білка Dna В. Цей білок розпізнає область почала реплікації і привертає до ori C інші білкові компоненти, які беруть участь в ініціації реплікації.
Ці допоміжні білки допомагають розкручувати і згинати ДНК.
1) Білок Dna В (ХЕЛІКАЗИ) взаємодіє з одноланцюжковий ділянками частково розплетеною ДНК. У цьому комплексі хеліказная активність Dna В блокована. Транслокация Dna В від місця її первинного входження в комплекс до місця старту репликативной вилки, яка з АТР-залежним звільненням з комплексу білка Dna С, викликає активацію гелікази. Далі ХЕЛІКАЗИ взаємодіє з білком Dna G (праймазой), і цей комплекс відіграє ключову роль в ініціації реплікації на Dna С. Обидва ферменти забезпечують поєднане функціонування двох реплікативних вилок, що рухаються в протилежні сторони: ХЕЛІКАЗИ починає розплітати ДНК, праймаза синтезує перші затравки. Комплекс білків, що здійснює ініціацію реплікації, отримав назву праймосомой. Праймосома в свою чергу є компонентом ще більш складного комплексу - реплісоми, що здійснює процес повної реплікації.
При утворенні реплісоми відбувається АТР-залежне формування дімерная комплексу холоферменту ДНК - полімерази III. пов'язаного з 3'-кінцями праймерів.
2) Терминация. Відбувається тоді, коли зустрічаються дві реплікативні вилки при подвоєнні кільцевих молекул ДНК.
ПРОЦЕС РЕПЛІКАЦІЇ У еукаріотів.
Механізми реплікації у еукаріот менш вивчені через їх більшої складності.
Особливості реплікації у еукаріот.
1) ДНК - полімерази еукаріот:
А) ДНК pol α - основний фермент, який здійснює елонгацію в напрямку 5 '# 8213; 3 'від 3'-ОН-затравки. Поєднує в собі активність полімерази і ПРАЙМАЗИ.
Б) ДНК pol β - фермент репарації (забудовує проломи).
В) ДНК pol γ - забезпечує синтез мітохондріальної ДНК.
Г) ДНК pol δ - працює в комплексі з ДНК pol α. здійснює коригувальну 5 '# 8213; 3 'екзонуклеазную активність.
2) Фермент теломераза - бере участь в реплікації теломерна ділянок.
В області теломер виявлені особливі послідовності з великою кількістю повторів. Перед репликацией теломераза подовжує 3'-кінець ДНК. При цьому частина нуклеотидів все ж втрачається.
Теломери в більшості клітин коротшають з віком, і це може бути важливим фактором, що визначає тривалість життя особини. Отже, вивчення роботи теломерази і регуляції її експресії в клітині допоможуть зрозуміти молекулярні основи процесів старіння і злоякісної трансформації живої клітини.
3) Багато репліконов. Швидкість реплікації нижче, ніж у прокаріот.
4) Довжина фрагментів Окадзакі 100-200 н.п.
5) Реплікація йде в S-період мітотичного циклу клітини.
Точність реплікації ДНК вельми велика - одна помилка на 10¹º нуклеотіділтраферазних реакцій. Але навіть якщо помилка допущена, вона може бути виправлена в ході репараційних процесів.
1.4. Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це комплекс молекулярно-генетичних методів, який дозволяє отримати in vitro велике число копій певної ділянки ДНК за участю специфічного ферменту - термостабільної ДНК полімерази (Taq - pol). Цей метод був розроблений в 1983 році американським вченим Мюлліса.
Склад реакційної суміші:
1. Два синтетичних олігонуклеотидних праймера (завдовжки приблизно по 20 нуклеотидів), комплементарні ділянкам ДНК