- З'явилася можливість зміни зовнішнього вигляду персонажа і озброєння.
- Розрахований на багато користувачів режим став важливою частиною сюжету, що розкриває діяльність Абстерго.
- Розширився асортимент здібностей персонажів.
Сюжет гри починається з того, що Дезмонд прокинувся в первинній тестової програми Анимуса, де вже знаходиться 16-й (як з'ясувалося, його ім'я - Клей Качмарек). 16-й пояснює йому, що Анимус намагається знайти Дезмонда і видалити, як шкідливий вірус, а Клей щосили намагається запобігти цьому. Дезмонд повинен буде пережити останні спогади своїх предків, і зіткнутися зі своїм власним минулим, і якщо це йому вдасться, то станеться сінхронексус і він зможе вийти з коми.
1511 рік. 52-річний майстер-ассасин Еціо Аудиторові та Фіренце вирушає на Схід, на батьківщину великого ассасина Альтаїра ібн Ла-Ахада, де шукає сліди загубленої бібліотеки ордена асасинів. Це небезпечну подорож обіцяє бути повним відкриттів і одкровень. Після прибуття в засніжений Масіаф Еціо виявляє, що місто окуповане візантійськими тамплієрами. Програвши битву з ними, Еціо дивом уникає смерті в полоні від руки жорстокого Леандро, капітана тамплієрів. Пробравшись в катакомби, Еціо виявляє, що для доступу до бібліотеки Альтаира потрібні п'ять печаток-ключів. Одна з печаток вже потрапила в руки тамплієрів, і Еціо належить відібрати в Леандро щоденник Нікколо Поло, в якому подано інформацію про ключах. Вийшовши з села, Еціо в возі переслідує Леандро, але візантійські бомбисти на бігу знищують віз і важко ранять Еціо. Ця гонитва привела його до поселення в горах, яке знаходиться під контролем візантійців. Пробравшись в цитадель, ассасін вбиває варту і самого Леандро. Перед смертю тамплієр віддає щоденник Еціо, сказавши, що книга йому вже не допоможе і один ключ вже знайдений візантійцями. Він також говорить, що тамплієрів не потрібні книги Альтаїра, а потрібні лише вказівки, які направлять їх до нікому Великому Храму.
Еціо відправляється в Константинополь, так як в щоденнику сказано, що саме там зберігаються печатки. Ассасин знайомиться з принцом Сулейманом, який представляється йому як учень. У порту Еціо зустрічає Юсуф Тазім, який радісно вітає майстра-ассасина. Юсуф розповідає про обстановку в регіоні: після падіння Візантійської імперії ассасини стали силою в місті. Але тамплієри швидко відновлюють вплив, і ассасини впевнені, що вони готові зробити переворот в найближчим часом. А султан Баязид II воює з синами, закриваючи очі на захоплення районів візантійцями. Показавши квартал Галата, Юсуф дарує Еціо ніж-гак, створений асасинами під кінець 15-го століття. Юсуф показує його в дії, і Еціо просить допомоги в пошуках печаток Альтаїра. Дізнавшись про напад на Північну Імперську базу, Юсуф відправляється туди, а тим часом Еціо командує обороною Галатської бази ассасинов, знищуючи візантійців. Потім вони роблять атаку на Північну Імперську базу в іншій частині міста. Повернувши базу і втративши багато ассасинов, Еціо починає розширювати Орден, запрошуючи вступити туди місцевих жителів. Через пару тижнів один член Ордена досяг звання ассасина і він хоче стати командиром бази. Він також говорить Еціо, що останнім часом зникли безвісти кілька ассасинов. Вночі вони в темному порожньому парку виявляють труп і кров ассасина. За допомогою Орлиного чуття Еціо бачить, що ассасін був убитий людиною в плащі з капюшоном. Тут-то якраз ця людина впадає в вічі Еціо і він влаштовує погоню. Але людина уникнув смерті від рук учня і його захистив загін візантійців. Учень розповідає, що ця людина - занепалий ассасін Валі, який мстить ордену і його потрібно знищити. Але Еціо не дозволяє битися учневі з таким сильним ворогом і відправляє учня в Бурсу на завдання. На наступний день Юсуф показує Еціо як створювати бомби. Еціо запитує, де в Імперському районі була лавка Поло. Вона повинна дати зачіпки де шукати ключі Масіаф. Юсуф радить Еціо запитати про це оттоманського картографа і навігатора Пірі Рєїса. Пірі на карті показує місце, де раніше знаходилася лавка. Картограф також обіцяє розповісти ассасина про використання особливих бомб, якщо він захоче. Прибувши на місце, Еціо виявляє, що на місці лавки Поло розташувався книжковий магазин чарівною венеціанки Софії Сарторі. У магазині Еціо знаходить потаємний хід у підземне пусте водосховище Цистерну Базиліка. Виявляється, там ведуть свої розкопки візантійці, які шукають другий ключ. Але Еціо вбиває трьох капітанів тамплієрів і вирізає весь візантійський загін, після чого він знаходить ключ Масіаф і карту. У магазині Еціо укладає угоду з Софією: вона розшифрує для нього карту, де треба шукати книги які вкажуть на місце розташування катакомб з ключами, а натомість Еціо після закінчення пошуків віддасть книги Софії.