Реферати >> Ботаніка та сільське гос-во >> Методи діагностики та профілактики мікробної контамінації при трансплантації ембріонів
Середу, призначену для культивування бактерій на чашках розливали по 20-25 мл і залишали на кілька хвилин до застигання агару. Коли було потрібно виростити мікроорганізми на агарезірованной середовищі у вигляді ізольованих колоній, чашки після засіву поміщали в термостат догори дном.
Відбір проб для бактеріологічних досліджень проводили на всіх етапах підготовки ембріонів до трансплантації.
2.2.1 Підготовка лабораторії, посуду та інструментів для маніпулювання з ембріонами
У приміщеннях лабораторії, де готували інструменти, обладнання, посуд, середовища для отримання, пересадки та кріоконсервації ембріонів, щодня проводили вологе прибирання.
Все обладнання боксу, його стіни, підлогу не рідше одного разу в тиждень мили миючими засобами і протирали дезінфікуючими розчинами. Для дезінфекції використовували 2% -й розчин хлораміну «Б». Перед роботою бокс та інші приміщення лабораторії опромінювали протягом 40-60 хвилин ультрафіолетовими променями з розрахунку 2-3 вт / м.
У боксі в день роботи з ембріонами проводили додаткову обробку столів і обладнання 96 ° етанолом.
Всі співробітники лабораторії працювали в стерильних халатах і змінному взутті. Спецодяг (халати, косинки, шапочки, марлеві пов'язки) прали не рідше одного разу в тиждень з обов'язковим кип'ятінням і прогладжуванням праскою. Взуття регулярно після закінчення роботи мили і знезаражували 2% -м розчином хлораміну.
Терміни, що вживаються для роботи з ембріонами інструменти, посуд стерилізували різними способами в залежності від матеріалу, з якого вони виготовлені.
Скляний посуд (флакони, колби, піпетки, циліндри та ін.), А також інструменти для пересадки ембріонів закривали пергаментним папером і стерилізували в автоклаві за 1,5 атм. протягом 30 хв. Потім сушили при температурі 80 ° С протягом 60 хвилин.
Шприци, голки, пінцети, ножиці, вагінальні дзеркала і системи для вимивання ембріонів стерилізували кип'ятінням протягом 30 хвилин.
Перед стерилізацією нову скляний посуд мили водопровідною водою з милом або порошком, за допомогою щіток і йоржів, ополіскували і занурювали в розчин соляної кислоти (1 ст. Ложка соляної кислоти на 3 літри дистильованої води) і витримували в ньому 24 години. Після чого посуд відмивали у проточній воді, а потім багаторазово в бі- і трідістіллірованной воді і висушували.
Вживаний скляний посуд мили в гарячому 2-3% розчині двовуглекислої соди, потім тщательноополасківалі водопровідною водою, після чого бі- і трідістіллірованной водою і висушували.
Колишні у вживанні металеві предмети також мили в вищевказаному розчині соди, ополіскували водопровідної, бі- і трідістіллірованной водою і висушували.
Одноразові полімерні інструменти (ампули, чохли, піпетки і ін.) Стерилізували в боксі шляхом їх опромінення бактерицидними лампами БУФ # 8209; 30 або ПРК # 8209; 2 протягом 20 хв. по обидва боки на відстані 20 см від джерела опромінення.
Гумові інструменти (катетер для вимивання) обробляли 70 ° С спиртом-ректифікатом. Зовнішню поверхню стерилізували, опромінюючи лампами БУФ # 8209; 30 в протягом 20 хв. на відстані 20 см від джерела ультрафіолетових променів, перед роботою ополіскували 2-3 рази середовищем Дюльбекко.
4.2.2 Підготовка донорів і реципієнтів
Підготовку донора починали в манежі з чищення та миття шкірного покриву і кінцівок. Потім тварина переводили в операційну, фіксували в верстаті, пряму кишку звільняли від вмісту. Для зняття напруги прямої кишки проводили епідуральну анестезію 2% -им розчином новокаїну в дозі 5 мл. За інструкцією зовнішні статеві органи і перенеальную область ретельно мили водою з милом, осушалі серветкою, дезінфікували аерозолем «септонекс» або 70 ° -м етанолом. У дослідах, корінь хвоста, область промежини і зовнішні статеві органи ретельно мили теплою водою з милом, осушалі ватним тампоном. Шкіру зовнішніх статевих органів і статеві шляхи (переддень піхви, піхву і вагінальну частину шийки матки) зрошували розчином Люголя. Для цієї мети хвіст відводили в сторону вперед, фіксували його за допомогою мотузки за передню перегородку верстата. У піхві вводили підготовлене вагінальне дзеркало. Через відкрите дзеркало зрошували слизові оболонки статевих шляхів розчином Люголя. Через 15 хвилин після санації статевих шляхів проводили витяг ембріонів.
Підготовку реципієнтів до пересадки ембріонів здійснювали також, як і підготовку донорів для нехірургічного вилучення зародків. Для запобігання занесення мікрофлори в матку реципієнта проводили санацію статевих шляхів розчином Люголя за 15 хв. до пересадки ембріонів.
Приготування розчину Люголя.
Розчин Люголя готували за такою прописи:
кристалічний йод - 1,0 г
йодистий калій - 2,0 г
дистильована вода - 300,0 мл.
2,0 г йодистого калію розчиняли в 100 мл води, додавали 1,0 г кристалічного йоду і ставили на 10-12 годин в термостат до повного розчинення йоду. При цьому йод розчиняється в йодистим калії. Розчин переливали в більшу мірну склянку і доводили загальний обсяг до 300,0 мл. Потім його фільтрували і зберігали у флаконах з темного скла. Розчин використовували не більше 30 днів.
4.2.3 Витяг і підготовка ембріонів до пересадки
Витяг ембріонів проводили на 7-8 день статевого циклу нехірургічним методом. Перед операцією донора готували за методикою, описаною в розділі 1.2, потім епідурально вводили 5-7 мл 2% -го новокаїну в залежності від ваги тварини. Неспокійним додатково вводили 0,3-0,5 мл ромпун. Ректально методом пальпації оцінювали стан статевого апарату, проводили підрахунки жовтих тіл і фолікулів. Для вимивання ембріонів використовували катетери різних конструкцій. Промивна рідина подавалася через закриту систему самопливом з ємності, розташованої у верхньому гнізді штатива над донором. Промивання маточного роги проводили 8-10 разів, вводячи по 60-50 мл промивної середовища. На вимивання одного рогу витрачали 450-500 мл модифікованої середовища Дюльбекко з додаванням 1% інактивованої сироватки крові великої рогатої худоби.
У науково-виробничих дослідах по санації промивних буферних середовищ додавали комплекс антибіотиків гентаміцин-ампіцилін в концентраціях 12 мкг / мл і 100 Од / мл, відповідно. Бактерицидну дозу санирующих препаратів відчували на штамах мікроорганізмів, як монокультурі, так і в асоціації, методом серійних розведенні. Нешкідливість санирующих препаратів для ембріонів визначали методом культивування ембріонів великої рогатої худоби в середовищах містять різні дози випробовуваних препаратів.
Ефективність застосування санирующих препаратів враховували за результатами приживлюваності ембріонів.
Змив відстоювали 15-20 хв. при температурі 37 ° С в термостаті. Надосадову рідину аспірованої за допомогою сифона. Осадочную середу розливали в стерильні чашки Петрі з розкресленим на смужки дном. Пошук зародків виробляли під стереоскопічним мікроскопом МБС-9.
Виявлені ембріони переносили стерильним мікрошпріцем на малу чашку Петрі діаметром 40 мм. Життєздатність ембріонів визначали за загальноприйнятою методикою оцінки морфологічного стану ембріона (В. Shea et al. 1976), з огляду на їх компактність, симетричність, щільність. (Інструкція по трансплантації ембріонів великої рогатої худоби, 1987).