Зростаюча потреба в пробіотичних препаратах і продуктах харчування обумовлює необхідність розробки нових ефективних і недорогих виробничих поживних середовищ для накопичення біомаси біфідобактерій. Виробничі поживні середовища повинні забезпечувати високу швидкість розмноження бактерій разом з мінімальною тривалістю їх ростового циклу для отримання високої концентрації життєздатних мікробних клітин в одиниці об'єму живильного середовища (не менше 10 8 КУО / мл). Сировина для приготування таких середовищ повинна бути доступною, недорогою, технологічно доцільною.
Біфідобактерії при первинному виділенні є строгими анаеробами. У присутності вуглекислого газу вони можуть бути толерантними до кисню. При лабораторному культивуванні ці мікроорганізми набувають здатність розвиватися в присутності деякої кількості кисню, а в високопоживних середовищах - рости в умовах повністю аеробних. Чутливість до кисню у багатьох штамів біфідобактерій варіює, що обумовлено відмінностями в механізмі бродіння.
Розмноження біфідобактерій обумовлено величезною кількістю чинників зростання. Багато видів вимагають біотин, пантотенова кислота, цистеїн, рибофлавін, пуринові і піримідинові підстави, пептиди, аміноцукри, кофермент А, олігосахариди, деякі ненасичені жирні кислоти та ін. Окремі штами вимагають вуглекислого газу, аміаку, гістидину. З амінокислот потрібно лізин, пролін, серин, аланін, аспарагінова і глутамінова кислоти.
У синтетичних середовищах біфідобактеріям для росту необхідні залізо, магній, фосфати, хлориди калію і натрію, в деяких випадках - марганець.
Біфідобактерії культивують, створюючи анаеробні умови або знижуючи окислювально-відновний потенціал середовища, на молоці, гідролізованому молоці і гідролізат казеїну, а також на печінковому бульйоні з додаванням ростових речовин (дріжджового автолізат, кукурудзяного екстракту, цистеїну і ін.). На щільних поживних середовищах біфідобактерії утворюють різноманітні колонії плоскі, напівкулевидні, блискучі, жорсткі, оточені валом, мають більш темний центр і т.д. Колір колоній змінюється від білого і сірого до темно-коричневого. Колонії часто нагадують формою зерно гречки або усічену трикутну піраміду, на деяких середовищах колонії мають форму сочевиці.
В даний час для накопичення біомаси Bifidobacterium longum використовують поживні середовища різного складу. Основою служать гідролізати і екстракти рослинного і тваринного походження: середа Блаурока на основі печінкового відвару, кукурудзяно-лактазная середу на основі кукурудзяного екстракту, середовища на основі отриманого м'ясного екстракту.
Для культивування біфідобактерій поширеним вважається печінково-цистеїнових середовище (середа Блаурока).
Для приготування середу Блаурока 500 г яловичої печінки, звільненої від сухожиль, пропускають через м'ясорубку, заливають подвійною кількістю води і кип'ятять протягом 2 годин, потім фільтрують. Фільтрат доводять дистильованою водою до 1 000 см і вносять 10 г пептона, 10 г лактози, 100 мг хлористого цистеїну, 5 г NаС1 і агару 1-2 м рН середовища 6,8-7,0. Однак це середовище дороге, містить дефіцитні компоненти, тому мало придатне для використання в промислових умовах.
У молочній промисловості для культивування біфідобактерій рекомендовано гідролізатную-молочна п'ятниця - ГМ-середовище, що містить гідролізат обрату, NaCl, лактозу, L-цистеїн солянокислий, пептони, агар-агар і воду. Гідролізатную-молочне живильне середовище готують наступним чином:
Приготування гидролизованного молока. Звичайна або відновлене знежирене молоко (молочний обрат) доводять до кипіння і кип'ятять 2 хв, охолоджують до 14oC, встановлюють pH 7,9 10-20% розчином NaOH.
Додають панкреатин з розрахунку 1 г / дм 3. попередньо розведений у невеликій кількості нагрітої до 44 o C води, розмішують і ставлять в термостат на 40 o С в ватяною пробкою. Протягом перших двох годин перемішування і корекцію pH до 7,9 проводять кожні 30 хв, в наступні дві години через кожну годину. Через 4 год від початку гідролізу додають 1-2% хлороформу, закривають гумовою пробкою і ставлять в термостат. Через 4 години доводять pH до 4,4 30% розчином оцтової кислоти, кип'ятять, помішуючи, не менше 15 хв, фільтрують через паперовий фільтр. Готовий гідролізат повинен містити 200-300 мг /% амінного азоту, прозорий, реакція його нейтральна або слабокисла.
Приготування гідролізатную-молочної середовища. Розводять гидролизованние молоко питною водою в співвідношенні 1: 1. У невеликій кількості розведеного гідролізату розплавляють агар в кількості 2,5 г на 1 дм 3 середовища. До решти кількості гідролізату додають 28 г пептона і 3,5 г хлористого натрію, суміш нагрівають до температури 80 o C, після чого змішують з розплавленим агаром. В суміші встановлюють pH 7,5, кип'ятять протягом 15 хв, дають відстоятися, зливають з осаду, що не фільтруючи, доливають гарячої дистильованої водою до заданого обсягу і додають в неї 10,0 г лактози і 0,15 г солянокислого цистеїну. Середа заливають в пробірки високим стовпчиком 10 см 3 і стерилізують при температурі 112 o C протягом 30 хв з попереднім підігрівом автоклава парою протягом 30 хв. pH готового середовища 7,1-7,3.
Гідролізатную-молочному середовищі широко використовується в Україні та інших країнах СНД для нарощування біомаси біфідобактерій. Це середовище забезпечує отримання біфідобактерій в концентрації 10 8 -10 9 КУО / мл. Воно досить просте у виготовленні. Разом з тим, ГМС має ряд недоліків. Основний з них - повільне зростання біфідобактерій. Так, при вирощуванні на цьому середовищі біфідобактерії досягають максимуму концентрації після 18-24 год культивування.
Для виділення та вирощування Enterococcus faecium існує ряд селективних середовищ: основа кров'яного агару з азидом, азідодекстрозній бульйон, KF-стрептококовий агар, М-агар для ентерококів, стрептококовий селективний агар та ін. На кров'яному агарі колонії ентерококів дрібні, кремові або білі, гладкі з рівним краєм, що розрізняються за типом гемолізу. Даний штам - гомоферментативних, газу не утворює кінцевий продукт ферментації глюкози і інших вуглеводів - молочна кислота. У ентерококів різко виражені редуціруя властивості: вони знебарвлюють лакмус і метиленовий синій в молоці, редуцируют нітрати в нітрити.
Для культивування Enterococcus faecium використовують азідно-глюкозний бульйон. Живильне середовище призначена для виділення і культивування ентерококів, виділених з досліджуваного матеріалу. Середовище є селективним і забезпечує прискорене зростання ентерококів. Азідно-глюкозний бульйон готують наступним чином: Приготування МПБ. 500 г дрібно нарізаного свіжого м'яса без кісток, жиру і сухожиль заливають в емальованій каструлі 1 л водопровідної води, нагрітої до 50 ° С, і залишають настоюватися 12 год при кімнатній температурі або 1 ч при 50-55 ° С. М'ясо віджимають, екстракт проціджують через марлю із шаром вати, кип'ятять протягом 30 хв для згортання колоїдних білків і фільтрують двічі (перший раз через марлю з ватою, другий - через паперовий фільтр). Фільтр доливають водою до 1 л, розливають в колби, закривають ватними пробками і стерилізують при 120 ° С 20 хв (пробки колб закривають зверху ковпачками з паперу). Ватні пробки повинні бути щільними, оскільки вони є фільтром, що перешкоджає проникненню бактерій з повітря після стерилізації. М'ясний бульйон може бути використаний в будь-який час для приготування відповідних середовищ. Якщо їх готують відразу, то попередня стерилізація зайва. Якщо бажано мати м'ясний бульйон особливо високої поживності, під час наполягання м'яса з водою додають трохи пепсину і подкисляют бульйон соляною кислотою. Пепсин додатково гідролізують білкові сполуки м'яса, і кількість засвоєних бактеріями поживних речовин зростає. М'ясо можна замінити м'ясним екстрактом, беручи його за 5 г на 1 л середовища.
Для приготування МПБ до 1 л м'ясного бульйону додають 5-10 г пептона (пептони - перший продукт гідролізу білка з високою молекулярною масою) для підвищення калорійності середовища та 5 г кухонної солі з метою створення осмотичної активності. Середа нагрівають до розчинення пептона, постійно помішуючи. Потім встановлюють нейтральну або слаболужну реакцію середовища, підливаючи 20% розчин Na2CO3 (до посиніння вологою червоною лакмусового папірця, при цьому фенолфталеїн ще не показує лужну реакцію - при додаванні його до середовища в порцеляновій чашці рожеве забарвлення не виникає). Зручно використовувати індикатор бромтимолблау. 1-2 краплі його вносять скляною паличкою в порцелянову чашку і додають краплю бульйону. У нейтральному середовищі бромтимолблау темно-зелений, у кислому - жовтий, в лужному - синій. Після установки реакції середу знову кип'ятять 5-10 хв і білки згорнулися від зміни реакції, фільтрують через паперовий фільтр без освітлення бульйону або освітливши його білком. Прозорий МПБ розливають в пробірки, закривають ватяними пробками і стерилізують при 120 ° С протягом 20 хв.
Приготування азідно-глюкозного бульйону. До 1 дм 3 МПБ додають 5,0 г пептона, 7,5 г глюкози, 2,5 г натрію хлориду, складові розчиняють нагріванням. Після цього охолоджують і встановлюють рН так, щоб після стерилізації при 25 ° С він становив (7,2 ± 0,1). Потім основу середовища стерилізують текучим паром (при 100 ° С) протягом 30 хв. В основу середовища, охолодженого до 50 ° С, додають 2,0 см3 натрію азид, і 2,0 см3 розчину бромкрезолового пурпурного. Готова середовище не стерилізують. Температурі Зберігати в захищеному від світла та висихання місці при (4 ± 2) ° С не більше 3 міс. Безпосередньо перед використанням її розливають по 5 см 3 в стерильні пробірки.
Так, біфідобактерії та ентерококи, поряд з іншими представниками нормальної кишкової мікрофлори, виконують і регулюють численні функції організму. У процесі життєдіяльності вони утворюють органічні кислоти, що призводить до встановлення нормального середовища для кишечника, перешкоджають розмноженню патогенної, гнильної і газоутворюючих мікрофлори кишечника. Сприяють процесам ферментативного перетравлення їжі, тому що підсилюють гідроліз білків, зброджують вуглеводи, омилюють жири, розчиняють клітковину, стимулюють перистальтику кишечника, сприяють нормальній евакуації кишкового вмісту.
Bifidobacterium longum ATCC 15707 в промисловості культивують, створюючи анаеробні умови або знижуючи окислювально-відновний потенціал середовища, на гідролізованому молоці. Для культивування Enterococcus faecium SF68 використовують азідно-глюкозний бульйон. Живильне середовище призначена для виділення і культивування ентерококів, виділених з досліджуваного матеріалу. Середовище є селективним і забезпечує прискорене зростання ентерококів.