A61K39 / 08 - Clostridium, наприклад Clostridium правця
Власники патенту RU 2428202:
Федеральна державна установа "Федеральний Центр токсикологічної та радіаційної безпеки тварин" (ФДМ "ФЦТРБ-ВНІВІ") (RU)
Винахід відноситься до галузі ветеринарної мікробіології. Вакцина містить наступні компоненти при співвідношенні на 1 л вакцини: суспензія клітин штаму №28 Cl.perfringens типу А в культуральному середовищі з концентрацією 3,5 · 10 12 -4,0 · 10 12. см 3 - 140,0-160,0 ; суспензія клітин штаму №392 Cl.perfringens типу С в культуральному середовищі з концентрацією 3,5 · 10 12 -4,0 · 10 12. см 3 - 140,0-160,0; суспензія клітин штаму №213 Cl.perfringens типу Д в культуральному середовищі з концентрацією 3,5 · 10 12 -4,0 · 10 12. см 3 - 140,0-160,0; суспензія клітин штаму E.coli KB-1, що містить адгезивний антиген К99 на фізіологічному розчині з концентрацією 100 · 10 12 -120 · 10 12. см 3 - 25,0-30,0, суспензія клітин штаму E.coli ПЗ-3, містить адгезивний антиген А20 на фізіологічному розчині з концентрацією 100 · 10 12 -120 · 10 12. см 3 - 25,0-30,0; гідроокис алюмінію, 6% -ва, см 3 - 200,0-250,0; формалін, см 3 - 4,0-5,0; термолабільние і термостабільні анатоксини штамів E.coli К99 і E.coli ПЗ-3 в співвідношенні 1: 1 в культуральному середовищі з титром в РДП 1: 8-1: 16, л - до 1 л. Вакцина викликає утворення напруженого імунітету у молодняка і дорослого поголів'я великої рогатої худоби тривалістю 12 місяців при дворазової вакцинації. У телят, отриманих від вакцинованих корів, формується після прийому молозива колостральной імунітет тривалістю до 1,5 місяців. 2 табл.
Винахід відноситься до галузі ветеринарної мікробіології і біотехнології, зокрема у виробництві і застосуванні біологічних препаратів проти анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї телят.
Ешеріхіоз - остропротекающая інфекційна хвороба молодняку, що виявляється септицемією, токсемією і ентеритом, зневодненням організму, ураженням нервової системи, наростаючою депресією і слабкістю, іноді пневмонією і артритами. Хвороба викликається ентеротоксичними штамами Escherichia coli (Е. coli), яка синтезує адгезивні антигени К88, К99, 987Р, F41, А20, Att25. У телят в більш 80% випадках ешеріхиоз викликається бактеріями E. coli, які продукують адгезивні антигени А20 і К99. Для профілактики ешеріхіоза в Україні застосовуються: «Вакцина полівалентна гидроокисьалюминиевую проти колібактеріозу (ешерихіозу) поросят, телят, ягнят», «Вакцина проти ешеріхіоза с.-г. тварин «Коли-Вак», що містить адгезивні антигени К99, К88, 987Р, F41, ТЛ-, ТС-анатоксини і соматичні антигени серотипів 078, 0141. Ці вакцини мають підвищену реактогенність для великої рогатої худоби за рахунок вмісту в ній високотоксичних штамів E. coli, які продукують адгезивні антигени К88 і 987Р, що не викликають захворювання у телят.
Вакцина проти анаеробної ентеротоксемії телят в Укаїни не розроблена і не випускається.
Відомо, що анаеробна ентеротоксемія у телят часто проявляється у вигляді змішаної інфекції з ешеріхіозов. Тому актуальна розробка асоційованої вакцини проти анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї телят.
Причиною неможливості використання цієї вакцини для імунізації телят є її вузький антигенний спектр (відсутність в складі вакцини антигенів Cl. Perfringens типів А, Д і адгезивного антигену E.coli А20, часто викликають захворювання у телят), висока її реактогенність через вміст в ній високотоксичних штамів E.coli, які продукують адгезивні антигени К88 і 987Р, що не викликають захворювання у телят.
Завданням винаходу є підвищення антигенної та иммуногенной активності, розширення спектра дії і захисного ефекту вакцини, а також зниження її реактогенності.
Поставлена задача вирішується тим, що вакцина асоційована проти анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї телят, що містить антигени клостридий, антигени ешерихій, інактиватор формалін і ад'ювант, з антигенів клостридий вона містить В-токсин і суспензію клітин штаму №28 Cl. perfringens типу A, В-токсин і суспензію клітин штаму №392 Cl. perfringens типу C, В-токсин і суспензію клітин штаму №213 Cl. perfringens типу Д, з антигенів ешерихій - суспензію клітин штаму E. coli КВ-1, що містить адгезивний антиген К99 на фізіологічному розчині, суспензію клітин штаму Е. coli ПЗ-3, що містить адгезивний антиген А20 на фізіологічному розчині, термолабільние і термостабільні анатоксини в культуральної середовищі, отримані при культивуванні штамів Е. coli КВ-1 і ПЗ-3 в культуральному середовищі, з ад'ювантов - гель гідроксиду алюмінію при наступному співвідношенні компонентів на 1 л вакцини:
Суспензія клітин штаму №28 Cl. perfringens типу А в культуральному середовищі з концентрацією 3,5 · 10 12 -4,0 · 10 12. см 3 - 140,0-160,0.
Суспензія клітин штаму №392 Cl. perfringens типу C в культуральному середовищі з концентрацією 3,5 · 10 12 -4,0 · 10 12. см 3 - 140,0-160,0.
Суспензія клітин штаму №213 Cl. perfringens типу Д в культуральному середовищі з концентрацією 3,5 · 10 12 -4,0 · 10 12. см 3 - 140,0-160,0.
Суспензія клітин штаму E. coli КВ-1, що містить адгезивний антиген К99 на фізіологічному розчині з концентрацією 100 · 10 12 -120 · 10 12. см 3 - 25,0-30,0.
Суспензія клітин штаму E. coli ПЗ-3, що містить адгезивний антиген А20 на фізіологічному розчині з концентрацією 100 · 10 12 -120 · 10 12. см 3 - 25,0-30,0.
Гідроокис алюмінію, 6% -ва, см 3 - 200,0-250,0.
Формалін, см 3 - 4,0-5,0.
ТС і ТЛ-анатоксини штамів E. coli КВ-1 і E. coli ПЗ-3 в співвідношенні 1: 1 в культуральному середовищі з титром в РДП 1: 8-1: 16, л. - До 1.
Клострідіозние антигени отримують з штамів Cl. perfringens №28, №392, №213, що відносяться відповідно до серогрупи А, С і Д.
Штами мають такі властивості. На середовищі Кітт-Тароцці бактерії дають бурхливе зростання з сильним рівномірним помутнінням бульйону і рясним газоутворенням. В мазках з культури бактерії представляють собою грампозитивні короткі товсті палички з обрубаними кінцями без суперечка. На глюкозо-кров'яному агарі бактерії утворюють великі, гладкі, опуклі колонії з рівними краями, оточені зоною сильного непрозорого (неповного) гемолізу. Культури токсичні, викликають загибель білих мишей протягом 12 годин.
Ешеріхіозной антигени отримують з епітеліотропним ентеротоксигенних штамів Escherichia coli «КВ-1» і «ПЗ-3», виділених з тонких відділів кишечника хворих на діарею новонароджених телят.
Штами мають такі властивості.
Морфологічні властивості: поліморфні, грамнегативні палички, не утворюють спор, розташовуються в мазках поодиноко.
Культуральні властивості: в мясопептонном бульйоні штами викликають інтенсивне помутніння, на мясопептонном агарі утворюють соковиті, блискучі, опуклі, гладкі з рівними краями колонії круглої форми. На середовищі Ендо колонії малинного кольору з металевим відливом.
Ферментативні властивості: ферментують глюкозу, лактозу, маніт, ксилозу і інші вуглеводи, які не розріджують желатину, утворюють індол, не утворюють сірководень.
Серологічні властивості: мають високу антигенну активність в РА, мають групоспецифічні і видоспецифічні антигени, штам "КВ-1" синтезує адгезивний антиген К99, штам «П3-3» - адгезивний антиген А20.
Що входять до складу асоційованої вакцини антигени в ефективних кількостях забезпечують синергетичний ефект, що проявляється в збільшенні напруженості і тривалості імунітету.
Приклад 1. Для виготовлення клострідіозних компонентів асоційованої вакцини виробничі штами Cl. perfringens №28, №392, №213 вирощують на м'ясо-печінково-казеїновій середовищі в реакторі протягом 5-6 годин при температурі 37-38 ° C до накопичення не менше 4 млрд / см3 мікробних клітин. Перевіряють токсичність вирощеної культури на білих мишах, які повинні загинути після внутрішньовенного введення 0,5 см 3 культури в термін до 24 годин.
Для виготовлення вакцини використовують культури, що містять не менше 6000 ДЛМ / см для білих мишей. У реактор додають формалін до 0,7% -ної концентрації, витримують 8 діб при температурі 37-38 ° C, додають 6% -ву гідроокис алюмінію до 10% -ної концентрації, витримують 3-5 діб і видаляють 50% загального обсягу надосадочной рідини, встановлюють рН 7,2-7,4.
Приклад 2. ешеріхіозной компоненти отримують з штамів E. coli КВ-1 і П3-3, що синтезують відповідно адгезивні антигени К99 і А20. Зазначені штами викликають загибель білих мишей масою 14-16 г протягом 24 годин після внутрішньочеревно зараження в дозі 500 млн м.к.
Для отримання бактеріальної маси Е. coli використовують м'ясо-пептони агар (для штаму П3-3) і середу Мінка (для штаму КВ-1). З цією метою зазначені поживні середовища розливають в Матри по 300 см 3 і стерилізують при 0,5 атм (110 ° C) протягом 15 хвилин. Після застигання середовищ роблять посів зазначених культур по 3,0 см 10 млрд суспензії. Посіви витримують в термостаті при температурі 37-38 ° C. Через 24 години виросли колонії культур E. coli змивають 0,85% -ним стерильним розчином хлориду натрію, готують суспензію в концентрації 100-120 млрд м.к. в 1 см 3 по бактерійних або оптичному стандарту мутності ГИСК ім. Тарасевича.
Інактивацію бактеріальної суспензії здійснюють формаліном. Для цього у суспензію додають формалін до 0,5% кінцевої концентрації і витримують 4-5 доби в термостаті при температурі 37-38 ° C. Потім перевіряють повноту інактивації шляхом посіву на відповідні поживні середовища.
Для отримання анатоксину кожен штам Е. coli засівають окремо в реактор з бульйоном Хоттингера, вирощують 5-7 діб при температурі 37-38 ° C. Визначають концентрацію ТЛ-, ТС-токсинів в реакції дифузійної преципітації (РДП). Титр ТЛ-, ТС-токсинів в культуральної рідини повинен бути не менше 1: 4-1: 8. Потім до культури додають формалін до 0,4-0,5% і витримують при температурі 37-38 ° C протягом 10-12 діб, потім додають 6% -ву гідроокис алюмінію до 10% -ної концентрації, витримують 3 діб та видаляють 50% загального обсягу надосадової рідини, встановлюють рН 7,2-7,4.
Приклад 3. Контроль вакцини на стерильність, нешкідливість і імуногенну активність. Для перевірки на стерильність з 6 флаконів кожної серії вакцини роблять посіви на МПБ, МПА, МППБ під вазеліновим маслом і агар Сабуро по 2 пробірки на кожен флакон. Посіви із середовищами витримують в термостаті при температурі 37-38 ° C, а агар Сабуро - при температурі 22-23 ° C протягом 15 діб. При цьому поживні середовища повинні залишатися стерильними.
Для перевірки на нешкідливість відбирають 10 білих мишей живою масою 16-18 г і вводять їм вакцину в дозі 0,5 см 3 підшкірно. Вакцину вважають нешкідливою, якщо миші протягом 10 діб після введення вакцини залишаються живими і клінічно здоровими. Контроль иммуногенной активності вакцини здійснюють на 3 кролях, яким препарат вводять внутрішньом'язово дворазово з інтервалом 15 днів в дозі 4 см 3. Через 20 діб після другої ін'єкції в сироватці крові кожного кролика визначають титр антитоксичних антитіл в реакції нейтралізації токсину Cl. perfringens на білих мишах. Вакцину вважають активної проти ентеротоксемії, якщо сироватка крові імунізованих кроликів охороняє не менше двох мишей з трьох, узятих в досвід, при загибелі всіх мишей контрольної групи. Імуногенну активність вакцини до ешерихій перевіряють на 40 білих мишах масою 16-18 р Вакцину вводять 20 мишам (досвідчені) підшкірно дворазово з інтервалом 10 днів в дозі 0,3 см 3. а 20 мишей (контрольні) НЕ вакцинують. Через 15 днів після другого введення вакцини тваринам вводять внутрішньоочеревинно подтітрованную смертельну дозу двох контрольних штамів E. coli (К99 і А20), використовуючи на кожен штам ешерихій 10 вакцинованих і 10 невакцінірованньгх тварин. Вакцину вважають активної проти E. coli при виживанні не менше 7 з 10 вакцинованих і загибелі не менше 8 невакцінірованньгх білих мишей.
Приклад 4. Ефективність вакцини оцінюють за кількістю хворих і полеглих від анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї телят в неблагополучному щодо цих інфекцій господарстві. Виробниче випробування експериментальної серії асоційованої вакцини проведено в СГВК «Дев'ятовського» Лаішевском району РТ, стаціонарно неблагополучному щодо анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї. Досліди проводилися на 46 глибокотільних корів і 60 телятах 30-35 денного віку. Коровам вакцину вводили підшкірно в дозі 10 см3 дворазово за 50-60 днів до отелення з інтервалом 15-18 днів. Телят імунізували у віці 18-20 днів також дворазово з інтервалом 15-18 днів в дозі 4 см 3. У результаті досліджень встановлено, що вакцина нешкідлива для тварин, не викликає ускладнень і створює у тварин активний поствакцинальний імунітет. Так, в групі новонароджених телят, отриманих від вакцинованих корів, захворюваність склала 13,1%, збереження - 89,9%, тоді як в групі телят, отриманих від невакцинованих корів, ці показники склали 78,8 і 77,7% відповідно. У групі телят старшого віку, вакцинованих асоційованої вакциною, захворюваність анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареєю склала 8,3%, збереження 91,6%, а в групі невакцинованих телят ці показники склали відповідно 21,9 і 73,9%. Отже, вакцина проти анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї телят має досить високу иммуногенной активністю. Застосування її з профілактичною метою в стаціонарно неблагополучному господарстві дозволило знизити захворюваність новонароджених телят в 6,4 рази, телят старшого віку - в 2,63 рази і тим самим підвищити безпеку новонароджених телят на 12,2%, телят старшого віку - на 17,7 % (див. табл.2).
Приклад 5. Загальні відомості біологічні властивості, порядок застосування вакцини асоційованої проти анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї телят.
Вакцина являє собою непрозору рідину солом'яно-жовтого кольору з рясним сірим осадом, який при струшуванні флакона легко розбивається, утворюючи гомогенну суспензію.
Флакони з вакциною упаковують в ящики з фанери, для забезпечення цілісності флакони обгортають папером або Алігнін, в холодну пору року - ватою або іншими теплоізоляційними матеріалами. Всередину кожного ящика вкладають 3 прим. інструкції із застосування вакцини.
Вакцину транспортують і зберігають в сухому, захищеному від світла місці при температурі від 4 до 8 ° C. Термін придатності вакцини 12 місяців з дня виготовлення при дотриманні умов транспортування і зберігання.
Вакцину з порушеною цілісністю флакона і зазнали заморожування, без етикеток, наявністю сторонніх домішок, а також не використану день відкриття флакона, вибраковують. Вибракувати вакцину кип'ятять протягом 15 хвилин.
Активними компонентами вакцини є антигени бактерій Clostridium perfringens типів А, С, Д і ешерихій коли, синтезують адгезивні антигени К99, А20, а також їх ТЛ- і ТС-анатоксини. Всі компоненти вакцини нешкідливі, мають високу імуногенність і повністю сумісні.
Вакцина при дворазовому введенні з інтервалом 18-20 днів у відповідних дозах викликає у молодняку і дорослого поголів'я великої рогатої худоби освіту напруженого імунітету тривалістю 12 місяців. У телят, отриманих від вакцинованих корів, формується після прийому молозива колостральной імунітет тривалістю до 1,5 місяців.
Порядок застосування вакцини
Вакцину застосовують з профілактичною метою в загрозливих і стаціонарно неблагополучних господарствах по анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозной діареї телят.
Вакцинації підлягають клінічно здорові тварини. У господарствах, неблагополучних по анаеробної ентеротоксемії і ешеріхіозов, специфічну профілактику починають з імунізації тільних корів і нетелів, яким вакцину в дозі 10 см3 вводять підшкірно дворазово за 50-60 днів до отелення з інтервалом 14-15 днів. Телят, отриманих від вакцинованих корів, вакцинують у віці 18-20 днів у дозі 3 см 3 дворазово з інтервалом 14-15 днів.
Перед застосуванням флакони з вакциною необхідно ретельно струшувати, а в холодну пору підігрівати на водяній бані до 37-38 ° C.
Молоко і продукти забою, отримані від вакцинованих тварин, в будь-який час після щеплення реалізуються без обмежень.
При проведенні щеплень необхідно дотримуватися правил асептики і антисептики. Місце введення вакцини дезінфікують 70% розчином етилового спирту. Шприци й голки перед застосуванням стерилізують кип'ятінням, для кожної тварини використовують окрему голку.
Поряд з вакцинацією тварин необхідно проводити в господарстві ветеринарно-санітарні заходи, спрямовані на знищення інфекційного початку.
Протипоказання до застосування:
- невакцинованих хворих і ослаблених тварин;
- не застосовувати гіперімунні сироватки або імунодепресанти протягом 1 місяця після вакцинації.
Заходи особистої профілактики
При проведенні вакцинації необхідно дотримуватися правил особистої гігієни, прийняті при роботі з лікарськими засобами. У місцях роботи повинна знаходитися аптечка для надання першої долікарської допомоги.
У разі потрапляння вакцини на відкриті ділянки тіла або слизові оболонки очей, рота, носа і після закінчення роботи руки та інші відкриті ділянки тіла миють водою з милом.
Вакцина після закінчення терміну придатності застосуванню не підлягає. Вакцину слід зберігати в місцях, недоступних для дітей.