Метод руйнування біологічного матеріалу азотної та сірчаної кислотами є основним методом, застосовуваним в хіміко-токсикологічних лабораторіях нашої країни.
На початку мінералізації концентрована сірчана кислота відіграє роль водовіднімаючих кошти. Її роль як водовіднімаючих кошти посилюється з підвищенням температури. Завдяки водовіднімаючих дії концентрована сірчана кислота порушує структуру клітин і тканин біологічного матеріалу. При підвищенні температури (вище 110 ° С) і концентрації (до 60-70%) сірчаної кислоти вона проявляє окислювальні властивості і розкладається з виділенням оксиду сірки (IV).
Азотна кислота, що знаходиться в суміші з сірчаною кислотою, спочатку мінералізації є слабким окислювачем. Згодом частина азотної кислоти при окисленні біологічного матеріалу перетворюється в оксиди азоту та азотної кислоти, які є автокатализаторов подальшого більш інтенсивного процесу окислення органічних речовин азотною кислотою. З утворенням оксидів азоту і азотної кислоти, а також з підвищенням температури азотна кислота проявляє себе як сильний окислювач.
В процесі нагрівання біологічного матеріалу з сумішшю азотної та сірчаної кислот відбувається не тільки руйнування органічних речовин цими кислотами, а й ряд побічних реакцій, до числа яких відносяться реакції сульфування і нітрування органічних сполук. Нитровании і сульфуванням в основному піддаються фенільні групи амінокислот, що утворюються при гідролізі білкових речовин кислотами. Нітрування і сульфування органічних речовин при руйнуванні біологічного матеріалу сумішшю азотної та сірчаної кислот є небажаним, так як нитро- і сульфосполук досить важко руйнуються сумішшю цих кислот.
При розведенні сірчаної та азотної кислот водою ступінь нітрування і сульфирования органічних сполук цими кислотами значно зменшується. Тому руйнування біологічного матеріалу проводиться не концентрованими, а частково розведеними азотної та сірчаної кислотами.
У процесі руйнування біологічного матеріалу сумішшю азотної та сірчаної кислот утвориться деяка кількість нітрозілсерной кислоти HOS02ONO, яка заважає виявленню катіонів деяких металів в мінералізат.
У першій стадії мінералізації відбувається деструкція біологічного матеріалу азотної та сірчаної кислотами, яка закінчується за 30-40 хв (про деструкції см. § 25). В результаті деструкції виходить прозора рідина (деструктат), що має жовтувату або бурого забарвлення.
У другій стадії мінералізації відбувається руйнування (окислення) органічних речовин, що знаходяться в рідкій фазі (деструктате), отриманої після деструкції біологічного матеріалу. Ця стадія руйнування більш тривала, ніж стадія деструкції.
Для остаточного руйнування органічних речовин, що знаходяться в рідкій фазі, до неї при нагріванні по краплях додають азотну кислоту. Повне руйнування органічних речовин в рідкій фазі залежить від кількості що додається азотної кислоти. Від додавання великої кількості азотної кислоти відбувається рясне виділення оксидів азоту, що виходять з колби і забруднюючих атмосферу лабораторії. Від додавання в колбу недостатніх кількостей азотної кислоти знаходяться в ній органічні речовини обугливаются гарячої сірчаної кислотою, про що свідчить потемніння рідини в колбі. При обвуглюванні органічних речовин сірчаною кислотою з рідини з вихідними газами можуть випаровуватися сполуки миш'яку і ртуті.
Руйнування біологічного матеріалу азотної та сірчаної кислотами вважається закінченим тоді, коли після припинення додавання азотної кислоти (при нагріванні колби) будуть виділятися білі пари сірчаної кислоти і не буде відбуватися почорніння мінералізату.
Отриманий мінералізат використовують для виявлення і кількісного визначення «металевих отрут». Однак виявлення і кількісного визначення катіонів деяких металів заважають азотна і азотистая кислоти, а також оксиди азоту, що знаходяться в мінералізат. У зв'язку з цим мінералізат, отримані після руйнування біологічного матеріалу, піддають денітрації.
Денітрація - процес звільнення мінералізат від азотної, азотистої, нітрозілсерной кислот і оксидів азоту. На перших етапах застосування методу руйнування органічних речовин азотної та сірчаної кислотами для денітрації мінералізат застосовувався так званий гідролізний метод. Цей метод заснований на розведенні мінералізат водою і на наступному нагріванні отриманих рідин. При нагріванні мінералізат, розбавлених водою, випаровуються азотна, азотистая кислоти і оксиди азоту, а нітрозілсерная кислота при зазначених умовах практично не випаровується. Вона поступово розкладається водою (гідролізується).
Азотистая кислота, що утворилася при розкладанні водою нітрозілсерной кислоти, випаровується при нагріванні. Для звільнення мінералізат від азотвмісних кислот і оксидів азоту (включаючи нітрозілсерную кислоту) за допомогою цього методу потрібно 15-17 год робочого часу.
Для денітрації мінералізат пізніше були запропоновані сечовина, сульфіт натрію і ін. За допомогою сечовини процес денітрації мінералізат закінчується за 3-5 хв (при 135- 145 ° С), а за допомогою сульфіту натрію - за 10-15 хв (при температурі вище 100 ° С).
У 1952 р Ф. В. Зайковский запропонував метод денітрації мінералізат формальдегідом. При взаємодії формальдегіду з азотною кислотою, яка майже завжди знаходиться в мінералізаті, виділяється азот:
В результаті взаємодії азотної кислоти з формальдегідом виділяються азот, оксид азоту (II), оксид вуглецю (IV) і вода:
Оксид азоту (II) окислюється киснем повітря до оксиду азоту (IV), який при взаємодії з водою дає азотну і азотисту кислоти:
Утворилися при цьому азотна і азотистая кислоти реагують з формальдегідом, як зазначено вище.
Нітрозілсерная кислота при нагріванні з водою розкладається. Новоутворена при цьому азотистая кислота реагує з формальдегідом, як зазначено вище.
Для денітрації мінералізат, отриманих при руйнуванні біологічного матеріалу азотної та сірчаної кислотами, до них додають 10-15 мл води. У цю рідину, нагріту до ПО- 130 ° С, обережно по краплях додають формалін (40% -й розчин формальдегіду). При цьому спостерігається рясне виділення бульбашок газу (N2 і N0), іноді має оранжево-бурого забарвлення (N02). Процес денітрації мінералізат формаліном закінчується за 1-2 хв. З цією метою потрібно від декількох крапель до декількох мілілітрів формаліну. Надлишок формальдегіду, який не вступив в реакцію з азотної і азотистої кислотами, видаляють нагріванням рідини протягом 5-10 хв.
Для перевірки повноти денітрації мінералізат проводять реакцію з розчином дифениламина (0,5 г дифениламина розчиняють в 100 г концентрованої сірчаної кислоти і додають 20 мл дистильованої води). На предметне скло або на порцелянову пластинку з поглибленням наносять 1-2 краплі мінералізату, до якого додають 1 краплю зазначеного вище розчину діфенламіна в сірчаної кислоти. При наявності азотної, азотистої кислот або оксидів азоту в мінералізаті з'являється синє забарвлення. Ця реакція заснована на окисленні дифениламина азотною кислотою і продуктами її розкладання. Спочатку при окисленні дифениламина утворюється безбарвний діфенілбензідін, при окисленні якого утворюється з'єднання, що має синє забарвлення:
Денітрація вважається закінченою тоді, коли реакція мінералізату з розчином дифениламина буде негативною. Якщо від додавання розчину дифениламина до мінералізат він забарвлюється в синій колір, то денітрації проводять повторно.
Виконання мінералізації. У колбу Кьельдаля місткістю 500-800 мл вносять 100 г подрібненого біологічного матеріалу, додають 75 мл суміші, що складається з рівних обсягів концентрованих азотної та сірчаної кислот і води. Колбу з вмістом в вертикальному положенні закріплюють в штативі так, щоб дно її знаходилося над асбестірованной сіткою на відстані 1-2 см. Над колбою Кьельдаля в штативі закріплюють ділильну лійку, в якій міститься концентрована азотна кислота, розведена рівним об'ємом води. Після цього починають обережно нагрівати колбу. Протягом 30-40 хв відбувається деструкція біологічного матеріалу. При цьому прозора рідина в колбі набуває жовтого або бурого забарвлення. Потім колбу Кьельдаля з вмістом опускають на асбестірованную сітку і підсилюють нагрівання. Для руйнування органічних речовин, що знаходяться в колбі, з крапельної воронки по краплях додають концентровану азотну кислоту, розбавлену рівним об'ємом води. Додаток азотної кислоти регулюють так, щоб з колби не виділялися бурі пари оксидів азоту. Мінералізація вважається закінченою тоді, коли прозора рідина (мінералізат) при нагріванні без додавання азотної кислоти перестане темніти, а над рідиною будуть виділятися білі пари сірчаної кислоти.
Отриманий мінералізат охолоджують, додають 10-15 мл дистильованої води і нагрівають до ПО-130 ° С, а потім обережно по краплях (уникаючи надлишку) додають формалін. При цьому наголошується рясне виділення бурих (іноді помаранчевих) парів. Після закінчення виділення цих парів рідина ще нагрівають 5-10 хв, а потім 1-2 краплі охолодженої рідини (мінералізату) наносять на предметне скло або на порцелянову пластинку і додають краплю розчину дифениламина в сірчаної кислоти. Негативна реакція мінералізату з дифеніламіном на азотну, азотисту кислоти, а також на оксиди азоту вказує на закінчення процесу денітрації. При позитивній реакції мінералізату з дифеніламіном денітрації проводять повторно.
Мінералізат, що містить більшість катіонів металів, буде безбарвним. В мінералізаті можуть бути катіони міді і хрому. В цьому випадку мінералізат буде пофарбований відповідно в синій або зелений колір. Якщо в біологічному матеріалі містилися барій і свинець, то в мінералізаті будуть опади сульфатів цих металів.
Методи виявлення та кількісного визначення катіонів в мінералізат описані в наступних розділах цієї глави.
Метод мінералізації біологічного матеріалу азотної та сірчаної кислотами має ряд переваг. Мінералізація цим методом відбувається швидше, ніж методом руйнування біологічного матеріалу хлоратом калію і соляною кислотою, а також деякими іншими методами. При використанні методу мінералізації біологічного матеріалу азотної та сірчаної кислотами виходять відносно невеликі обсяги мінералізат. Ця обставина впливає на чутливість методів виявлення «металевих отрут» в мінералізат.
Однак цей метод непридатний для ізолювання ртуті з біологічного матеріалу, так як значні кількості її випаровуються при нагріванні біологічного матеріалу з сірчаної та азотної кислотами. Метод ізолювання ртуті з біологічного матеріалу описаний нижче