Винахід відноситься до медицини, зокрема імунології, і може бути використано для імунопрофілактики та імунотерапії дифтерії.
Традиційним способом лікування дифтерії є внутрішньом'язове введення протидифтерійної сироватки (ПДС), отриманої з крові коней, гіперімунізованих дифтерійним анатоксином, що містить специфічні імуноглобуліни, нейтралізують токсини дифтерійних бактерій. В 1 мл сироватки міститься не менш як 1500 міжнародних антитоксичних одиниць активності (МЕ). Будучи ефективним способом лікування дифтерії, ПДС має низку недоліків: введення значної кількості чужорідного білка обумовлює можливість розвитку анафілактичних реакцій і сироваткової хвороби (Фаворова Л.А. та ін. Дифтерія. - М. Медицина, 1988. - С. 187-192).
Однак цей спосіб не дозволяє отримувати препарати з високим ступенем очищення: кінцевий продукт являє собою комплекс F (ab) 2-фрагменти імуноглобулінів різної специфічності, причому антитіла (антитоксини) проти того антигену, яким імунізувати продуцент, складають не більше 25% від загального вмісту білка . Внаслідок цього антитоксичні сироватки залишаються перевантаженими баластними білками і в ряді випадків можуть викликати анафілактичні реакції різного ступеня тяжкості з боку реципієнта. Крім того, препарати контаміновані груповими речовинами крові (ГВК), що може також стати причиною ускладнень при введенні сироваток.
Технічний результат винаходу полягає в отриманні високоочищеного протидифтерійного препарату зі зниженою реактогенностью з гетерогенного сировини. Препарат для профілактики і лікування дифтерії є ліофілізований форму.
Завдання вирішується шляхом отримання препарату для профілактики і лікування дифтерії з ферментованої гіперімунною сироватки коня із застосуванням іммунноаффінной очищення.
Отриманий препарат є монофракціонним, в той час як препарат-прототип має яскраво виражені домішки неактивного білка (фіг. 1). Препарат для профілактики і лікування дифтерії є монорецепторними: в реакції подвійної імунодифузії з дифтерійним анатоксином утворює одну лінію преципітації, в той час як сироватка (прототип) - 2-3 лінії (фіг. 2).
Характеристика препаратів, отриманих за відомими способами і запропонованим, представлена в табл. 1-3.
Високий ступінь очищення і відсутність ГВК забезпечують зниження реактогенності препарату для профілактики і лікування дифтерії, отриманого з гетерогенного сировини (табл. 1, 2), при цьому він має високі протектівнимі властивостями: мінімальна доза антитоксина в сироватках крові 0,03-0,125 МО / мл , відповідна захисному титру при дифтерії, захищає 100% тварин від введення 1,8-5,6 LD50 дифтерійного токсину (табл. 3). Ліофільні висушування дозволяє отримувати високоактивні сухі дозовані препарати, придатні для тривалого зберігання.
Для приготування препарату для профілактики і лікування дифтерії використовують гипериммунную кінську сироватку, для чого її ферментують пепсином, здійснюють солевое фракціонування білків і термоденатурацію баластного білка. Виділення цільового продукту з ферментованої гіперімунною сироватки здійснюють із застосуванням специфічного імуносорбенту, що містить в якості ліганда очищений концентрований дифтерійний анатоксин. Препарат концентрують за допомогою ультрафільтрації на мембранах з порогом затримання речовин з молекулярної масі 100 кБ. Стерилізуючу фільтрацію проводять на мембранах з діаметром пір 0,22 мкм.
Приклад 1. ферментолиз гіперімунною сироватки.
30 л гіперімунною кінської сироватки завантажують в реактор і розбавляють 60 л апірогенної дистильованої води до змісту 3% білка. Вносять при помішуванні 243 г пепсину, розчиненого в невеликій кількості підкисленою дистильованої води. Протеолиз проводять при pH 3,2 при кімнатній температурі 1 ч і 1 ч при pH 4,2. (PH доводять до потрібного значення 2,5 моль / л розчином соляної кислоти або 2,5 моль / л розчином гідроксиду натрію).
Після закінчення 2-ої години протеолізу в реактор через завантажувальний люк додають 14,5% сульфату амонію (13 кг), pH доводять до значення 4,3-4,33. Суміш підігрівають до 56 o C і витримують при цій температурі 45 хвилин. Після цього ферментат звільняють від баластного білка фільтрацією через міткалеві касетні фільтри. Осад баластних білків відкидають, а прозорий фільтрат, що містить білки з антитоксической активністю, збирають і підводять в ньому pH до 7,0-7,2.
2. Приготування моноспеціфіческой імуносорбенту.
Для отримання імуносорбенту використовують стандартний препарат ціанбромірованной сефарози 4В ( "Pharmacia, Швеція"), а в якості специфічного ліганду - очищений концентрований дифтерійний анатоксин з активністю 450 Lf / мл. 200 г сухої сефарози заливають двома літрами 0,001 моль / л розчину соляної кислоти на 30 хвилин і відмивають від консервантів тим же розчином. 1,2 л дифтерійного анатоксину з'єднують з осадом набряклою сефарози (900 мл), добре перемішують і витримують при температурі 4 o C протягом 24 годин. Після чого визначають обсяг надосадової рідини (V1) і титр анатоксину (T1) в реакції флокуляції. Якщо титр не перевищує 10 Lf / мл, то декантат відкидають, в іншому випадку сорбцію продовжують. Утворений комплекс сефароза - анатоксин відмивають від незв'язаних білка стерильним апірогеним карбонатно-бікарбонатним буферним розчином pH 9,0 під контролем спектрофотометрії. Останню порцію промивних вод після встановлення нейтрального pH перевіряють на пирозі за загальноприйнятою методикою.
При відсутності пирогенов в промивних водах вільні активні групи ціанбромірованной сефарози блокують двома літрами 1 моль / л розчину етаноламіну pH 9,0 протягом двох годин в затемненому місці при постійному помішуванні.
Імуносорбент трикратно відмивають чергуються стерильними апірогенної буферними розчинами: 2 л ацетатного pH 4,0; 2 л борово-боратного pH 8,0. Промивні води (V1) контролюють на наявність дифтерійного анатоксину в реакції флокуляції (T2). Титр імуносорбенту розраховують за формулою де A - титр імуносорбенту; V, T - обсяг і титр анатоксину; V1. T1 - обсяг і титр надосадової рідини; V2. T2 - обсяг і титр промивних вод; C - обсяг імуносорбенту.
Таким чином, отримують 900 мл суспензії імуносорбенту з титром 588 Lf / мл.
3. Виділення монорецепторними фракції F (ab) 2-фрагменти IgG коні, концентрування препарату.
Для виділення F (ab) 2-фрагменти IgG коні використовують бесколоночний "Batch" -метод. При цьому всі використовувані ємності і розчини повинні бути стерильними і апірогенної. Сорбент і ферментовану антитоксичну сироватку з активністю 110 МО / мл з'єднують в кількостях, еквівалентних за титром
де Vф. Tф - обсяг і титр ферментата,
Vі.с .. Tі.с. - обсяг і титр імуносорбенту.
Тобто однієї порції імуносорбенту досить для виснаження 4,8 л ферментованої протидифтерійної антитоксичної сироватки.
Сорбцію специфічних антитіл проводять при кімнатній температурі протягом 1 год, pH 7,0. Сорбент відмивають від незв'язаних білків стерильним апірогеним забуферений фізіологічним розчином (ЗФР) pH 7,0 до нульової позначки за показаннями спектрофотометра. Як елюента використовують стерильний апірогенний ЗФР, підкислений до pH 2,2 - 2,4 1 моль / л соляною кислотою.
Імуносорбент відмивають від білка ЗФР (pH 7,0) і зберігають в стерильному апірогенної борово-боратному буферном розчині (pH 8,0) при температурі 4 o C. Імуносорбент використовують багаторазово (до 20 разів).
Отримують 3 л концентрованих аффінноочіщенних F (ab) 2-фрагменти IgG коні з активністю 2500 МО / мл і білком 3%. Очищений концентрований антитоксин освітлюють за допомогою послідовної фільтрації через мембрани з діаметром пір 0,8-0,65-0,45 мкм. Стерилізуючу фільтрацію проводять на мембранах з діаметром пір 0,22 мкм. Стерильний препарат для профілактики і лікування дифтерії розливають в ампули по 1,0 мл.
Ампули з препаратом для профілактики і лікування дифтерії поміщають в приймальню касету і ставлять на заморожування в низькотемпературний прилавок апарату ТГ-50, що забезпечує температуру заморожування не менше мінус 38 o C. При примусової вентиляції препарат заморожують протягом не менше 18 год, без примусової вентиляції не менше 20 ч. Завантаження продукту в субліматор проводиться після досягнення конденсатором температури не вище мінус 50 o C, полиць не вище мінус 15 o C. Після чого субліматор вакуумируют. Точка розморожування препарату мінус 33-36 o C. При досягненні препаратом температури не вище мінус 38 o C і стабілізації вакууму не більше 9 Па починають підігрів полиць. Через годину після завантаження підігрів на 0 o C і далі по 5 o C на годину. Кінцева температура нагріву полиць 34-40 o C. Після витримування препарату при плюсовій температурі протягом 20 год сушка вважається закінченою.
Таким чином, запропонований спосіб дозволяє отримувати препарат для профілактики і лікування дифтерії зі зниженою реактогенностью, що володіє високими протектівнимі властивостями, в ліофілізованої формі.
1. Препарат для профілактики і лікування дифтерії, що містить F (ab) 2-фрагменти IgG коні, який відрізняється тим, що він являє собою монорецепторними фракцію F (ab) 2-фрагменти IgG коні з активністю протіводефтерійних антитіл щонайменше 2500 МО / мл і містить як допоміжну речовину 0,9% розчин хлориду натрію з pH 6,8 - 7,2 при наступному співвідношенні інгредієнтів:
Монорецепторная фракція F (ab) 2-фрагменти IgG коні з активністю протидифтерійних антитіл щонайменше 2500 МО / мл - 3 - 4 мас.%
0,9% розчин хлориду натрію з pH 6,8 - 7,2 - До 1 мл
2. Препарат для профілактики і лікування дифтерії по п.1, що відрізняється тим, що являє собою ліофілізований форму.
3. Спосіб отримання препарату для профілактики і лікування дифтерії, що включає ферментолиз гіперімунною кінської сироватки пепсином, який відрізняється тим, що після ферментації здійснюють солевое фракціонування і термоденатурацію білків сироватки, виділення цільового продукту здійснюють за допомогою специфічного імуносорбенту, що містить в якості ліганда очищений концентрований дифтерійний анатоксин, з подальшою концентрацією методом ультрафільтрації на мембранах з порогом затримання речовин з молекулярної масі 100 Д, стерилизующей фільтрацією на мембранах з діаметром пір 0,22 мкм.