Головна | Про нас | Зворотній зв'язок
Передумовою для отримання хороших гістологічних зрізів служить правильний вибір кута нахилу ножа і кута різання.
Під кутом нахилу розуміють кут, утвореною нижньою поверхнею ножа з площиною різання. Найкращий вважається такий кут нахилу, при якому площина заточування ножа розташована паралельно верхньої поверхні блоку. Зазвичай він дорівнює. Якщо ніж встановлений так, що кут нахилу більше оптимального, то зріз буде кришитися, якщо менше - різка неможлива, так як лезо ножа буде лише ковзати по поверхні блоку.
Під кутом різання мають на увазі кут між довгою віссю ножа і уявною лінією, що йде через центр блоку паралельно руху санчат, які несуть ніж. Величина кута різання залежить від властивостей оброблюваного матеріалу: чим він м'якше, тим кут менше, і, навпаки, чим твердіше, тим кут більше. При косому розташуванні ножа зменшується опір його ріжучого краю поверхні блоку, що полегшує різання м'яких блоків.
Різання на мікротому
Для того щоб зріз можна було дослідити в мікроскоп, необхідно, щоб структурні компоненти складових його тканин були добре помітні в світлі і щоб зріз був захищений від можливого забруднення і пошкодження. Тому подальша обробка зрізу передбачає його фарбування, просвітлення і висновок.
Блок піддають обрізку, видаляючи вільний чистий парафін (т. Е. Розташований поза тканини). З бічних сторін блоку залишають лише у вигляді площадки з матеріалом. Якщо не зробити такого видалення парафіну, то зрізи будуть не гладкими, а зморшкуватими (опуклими) в середині з тієї причини, що чистий парафін, що залишається з боків, скорочується під час різання більшою мірою в порівнянні з парафіном, просочують тканину.
Неприємний момент сморщивания зрізів можна зменшити, піддаючи блок охолодження (лід), Т. е. Повідомляючи йому велику твердість.
Готуючи парафіновий блок до різання при необхідності отримання стрічок треба прагнути надавати йому правильну прямокутну форму. Парафіновий блок міцно закріплюють в затиску мікротома, розташувавши паралельно довжині мікротома. Потім, встановивши необхідний кут різання і правильний кут нахилу ножа, його міцно закріплюють гвинтами зажимами і розташовують під блоком. При строго поперечному положення ножа дуже щільний об'єкт змушує вібрувати його, що супроводжується характерним скрипом і утворенням поперечних смуг на поверхні блоку.
Після цього, регулюючи гвинтами механізм подачі, блок встановлюють таким чином, щоб верхня його площина була до леза ножа на 0,5-1 мм. Коли попередня підгонка блоку до ножа закінчена, встановлюють мікрометричними шкалу на отримання товстих (25-30 мкм) зрізів і рухом ножових санчат починають подавати блок вгору до отримання з нього перших повних зрізів. Потім проводять моделювання блоку: зрізають скальпелем надлишковий парафін, залишаючи навколо залитого об'єкта шар не більше 2-3 мм, і надають блоку прямокутну форму. Після цього встановлюють мікрометричними шкалу на потрібну товщину зрізу і приступають до остаточної різанні матеріалу.
Слід пам'ятати, що переміщення ножових санчат уздовж рейкового шляху потрібно виконувати плавно, без зайвих зусиль. Не можна натискати на рукоятку зверху, так як це проводить до витіснення шару масла, що знаходиться між ковзними поверхнями, і опускання ножа, внаслідок чого зрізи виходять нерівномірними. Рух мікротомних ножем в момент проходження над блоком треба робити швидко.
Правильно залиті невеликі шматочки органів і тканин при оптимальному температурному режимі в приміщенні ріжуться добре, і зріз, як правило, лягає на ніж в розправленому стані (кут різання прямий). При різанні великих блоків і твердого матеріалу зрізи часто закручуються. Однак цього можна уникнути шляхом притримування і підведення зрізу пензликом за передній його край в процесі різання. Проти закручування зрізів допомагає і зменшення їх товщини. При косому положенні ножа зрізи будуть поодинокими, але зате різка йде різка легше і зрізи виходять більш тонкими.
Так як парафін сильно тупить ножі, то для різання парафінових блоків краще застосовувати ножі твердої гарту, з товстим клином.
Товщина парафінових зрізів коливається від 3-5 до 15 мкм і залежить як від якості заливки матеріалу, так і від ножа.
Потрібно стежити, щоб зріз ні притиснутий до ножа, так як при цьому, відбувається його приклеювання і пошкодження. Готовий зріз обережно знімають з ножа вологим пензликом (в напрямку від спинки до леза) і переносять в чашку з теплою (350-400С) водою. Поміщають зрізи на воду обов'язково поверхнею, прилеглої до ножа, визначити яку можна по характерному блиску (верхня сторона завжди матова).
При різанні треба стежити, щоб волоски від пензлика не потрапляли під ріжучий край ножа, так як це призводить до пошкодження леза.
Для наклеювання розправлені зрізи виловлюють із води на заздалегідь підготовлене предметне скло; для цього скло одним кінцем опускають в чашку з водою, проводять під зріз і підхоплюють його, утримуючи препаровальной голкою на середній частині скла. Залишки води навколо зрізу ретельно видаляють ганчіркою і пропрасовують пальцем через 2-3 шари сухої і теплої ганчірочкою.
Так як парафінові зрізи при наклейці вбирають воду, то щоб уникнути непорозумінь при подальшій обробці (т. Е. Забарвленні) необхідно їх ретельно просушити, тільки після цього приступити до фарбування.
Недостатньо висушені зрізи легко відклеюються під час фарбування, а головне, погано звільняються від парафіну при обробці ксилолом. Критерієм добре висушених зрізів є придбанням ними більшої прозорості в порівнянні з білими погано просушеними зрізами.
Якщо доводиться поспішати з фарбуванням, то рекомендується свежепріклеенние і трохи підсохлі (в термостаті або на повітрі) зрізи злегка подогреветь на платформі електроплити, обережно доводячи парафін до ознак початкового оплавлення, але не повного розплавлення. Така обробка сприяє більш міцної фіксації зрізів на предметному склі.
Для того щоб зрізи міцно пристали до предметного скла і не відклеїлися під час фарбування, скла спеціально обробляють з метою знежирення. Для цього їх грунтовно миють в гарячій мильній воді або тривало кип'ятять в 2-3% содовому розчині, потім добре промивають в чистій гарячій воді і промивають (кілька годин) в проточній.
Оброблені і промиті в воді предметні скельця протирають лляної ганчіркою, тримаючи скла за краю; і зберігають в 960 спирті або в суміші спирту ефіром, звідки їх у міру потреби виймають пінцетом і висушують. На добре знежиреному предметному склі вода повинна розтікатися тонким шаром, а не збиратися в краплі.
Хороші предметні скельця повинні бути з білого скла і мати абсолютно рівну поверхню, товщина їх не повинна перевищувати 1,2 мм.
Перед самою наклейкою зрізів висушені скла покривають тонким шаром суміші білка з гліцерином.
Приготування білка з гліцерином. Беруть свіжий яєчний білок (без домішки жовтка), збивають виделкою або шпателем до стану піни і виливають на великий шірокопорістий фільтр, попередньо змочений дистильованою водою. Фільтрація триває близько 24 годин. До профільтрувати білку додають рівний об'єм гліцерину, розмішують і додають шматочок тимолу для попередження загнивання.
Приготування предметного скла з білком. На сухе предметне скло скляною паличкою наносять маленьку крапельку суміші білка з гліцерином і пальцем ретельно розмазують тонким шаром. Руки повинні бути попередньо вимиті, а палець, яким виробляють розмазування суміші, оброблений спиртом. Нанесений на скло шар білка з гліцерином згортають при невеликому нагріванні (50-600) для чого скло проводять 2-3 рази над гарячою електроплиткою. Після такої обробки предметне скло вважається готовим і на нього можна наклеювати зрізи.
Можливі похибки при виготовленні парафінових зрізів
Для того щоб отримати хороші гістологічні зрізи, необхідно вміти вчасно розпізнати і усунути причину, яка погіршує якість зрізів.
а) Зріз кришиться.
1) твердий парафін
2) низька температура навколишнього середовища
3) повільне охолодження парафіну при заливці
4) великий кут нахилу ножа
1) залити матеріал в більш м'який парафін після попереднього розтоплення блоку в термостаті
2) дихати на поверхню блоку (зігрівання) перед кожним рухом ножа або пристосувати ел. плиту поруч з мікротомів
3) змінити кут нахилу ножа.
б) Залитий матеріал в процесі різання випадає з навколишнього маси парафіну.
1) при перенесенні шматочка в формочку для заливки відбулося його охолодження.
1) необхідно блок розтопити в термостаті і залити заново, строго дотримуючись правил заливки, після попереднього розтоплення матеріал переносять в проміжні зрізи (для видалення спирту), потім знову просочують і заливають
2) заливка проведена охолодженим парафіном
3) недостатнє видалення спирту перед просочуванням.
в) Площина зрізу нерівна, матеріал погано ріжеться або зовсім не ріжеться, ніж підскакує над поверхнею блоку.
1) перевтома матеріалу при проводці і фіксації.
Неможливо. Можна лише кілька розм'якшити матеріал, якщо на поверхню різання перед кожним рухом ножа наносити шар гарячого парафіну пензликом (давши йому потім охолонути) або дихати на поверхню блоку.
г) Зрізи закручуються, прилипають до поверхні ножа, мнуться.
1) малий кут нахилу ножа
2) м'який парафін
3) висока температура навколишнього середовища.
1) змінити кут нахилу
2) залити матеріал в більш твердий парафін і охолодити блок шляхом приміщення перед різкою в холодильник (можна також покласти на поверхню різання шматочок льоду)
3) приклеювання, зморщування або розрив зрізів, особливо при різанні органів, багатих кісткової, хрящової або щільної сполучної тканини, можуть бути наслідком їх електризації.
поміщати на лезо (в місці проходження зрізу) краплю води, дихати на лезо і блок, натирати ділянку леза і прилеглу частину ножа шматком твердого парафіну.
е) Зрізи розриваються або покриті борознами.
1) щербини на лезі ножа
2) брудний парафін (щільні смітинки дряпають зріз і псують лезо);
3) матеріал погано декальцінірованний.
1) точка і правка ножа або переміщення в ножедержателе
2) перезаливка в чистий парафін
3) усунути не можна.
ж) Площина зрізу не однорідна (білувата в середній частині).
Розплавлення блоку і проведення матеріалу через проміжні зрізи до абсолютного спирту. Після зневоднення проводять через проміжну середу, просочують і заливають.