Особливості роботи в умовах стерильної лабораторії

При роботі в стерильному приміщенні лабораторії всі співробітники бактеріологічної лабораторії зобов'язані дотримуватися таких правил роботи, які забезпечують стерильність в роботі і попереджають можливість виникнення внутрішньолабораторний заражень:

1. Всі особи, що знаходяться в лабораторії, повинні бути в халатах, змінному взутті (або бахилах), білій шапочці або косинці.

2. У приміщенні забороняється прийом їжі і паління, зберігання продуктів харчування.

3. Не можна вносити в лабораторію сторонні речі.

4. Забороняється виходити за межі лабораторії в халатах або надягати верхній одяг на халат.

5. Кожен працівник повинен користуватися тільки своїм робочим місцем.

6. Всі операції повинні проводитися з дотриманням правил стерильності: все стерильні роботи проводять поблизу полум'я пальника, переливання заражених рідин виробляють над лотком з дезинфікуючим розчином і т. П.

7. Потрібно строго стежити за чистотою рук: після закінчення роботи із заразним матеріалом їх дезінфікують. Робоче місце в кінці дня упорядковують і ретельно дезінфікують.

8. Весь інвентар, який перебував в контакті із заразним матеріалом, підлягає стерилізації або знищення.

Біотехнологічну лабораторію необхідно утримувати в чистоті. Слід регулярно проводити гігієнічне прибирання приміщень лабораторії. Забезпечити повну стерильність лабораторії дуже важко і це не завжди необхідно, але значно знизити кількість мікроорганізмів в повітрі і на різних поверхнях в лабораторних приміщеннях можливо. Це досягається шляхом застосування на практиці методів дезінфекції, тобто знищення збудників інфекційних хвороб на об'єктах зовнішнього середовища.

Для культивування стерильних проростків необхідно використовувати ламінар-бокси, що забезпечують посадку експлантов на живильне середовище без зараження мікроорганізмами.

Всі поверхні ламінарії обробляються 96% спиртом, простерилізовані інструменти, матеріали, рослинний матеріал поміщають на стіл ламінарії і включають УФ-випромінювання. Через 20 хвилин вимикають УФ і включають біофільтри. Для роботи в ламінар-боксі надягають стерильний халат і шапочку, руки обробляю 96% спиртом. Пінцети, скальпелі і препаріровальние голки поміщають в стакан з 96% спиртом. Перед кожною маніпуляцією інструменти обпалюють на полум'ї спиртівки. У разі порушення стерильності на середовищах добре розвиваються мікроорганізми (гриби, бактерії), що порушують склад середовища і пригнічують ріст рослинних експлантів.

Посуд, халати, вату, папір, дистильовану воду, поживні середовища стерилізують в автоклавах під тиском пара 1-2 атмосфери і температурою 120 ° С протягом 20-60 хв, в залежності від обсягу стерилізується матеріалу.

Колби, штативи з середовищем, вату, папір, халати перед автоклавуванням загортають в целофанову папір, або поміщають в бікси.

Металеві інструменти автоклавувати не можна, так як під дією пара утворюється іржа. Тому їх стерилізують сухим жаром в термостатах з температурою 170-250 о С протягом 1-2 годин.

Лабораторна робота № 1

Тема. «Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії, правила роботи в ній»

Матеріали та обладнання:

Хімічні склянки (50, 100, 250 мл), штативи з пробірками, інструменти (пінцети, скальпелі, ножиці, препаріровальние голки), миючі засоби, (пральний порошок), хромпик, гіпохлорит натрію.

1. Ознайомитися з пристроєм біотехнологічної лабораторії.

2. Під керівництвом викладача освоїти принципи роботи автоклава, сушильного шафи, дистилятори та іншого допоміжного обладнання.

3. Посуд замочити в розчині гіпохлориту натрію, ретельно відмити в розчинах детергентів (пральний порошок), промити 8-10 разів проточною водою, помістити на 4-6 годин в хромпик (суміш сірчаної кислоти з біхроматом калію), промити теплою водою, потім двічі дистильованої.

4. Чистий посуд помістити в сушильну шафу на 2 години при температурі 100-130 о С.

5. Суху посуд для зберігання закрити ватяними пробками, фольгою, целофаном.

Контрольні питання до теми 1.

1. Як влаштована біотехнологічна лабораторія?

2. Як простерилізувати живильні середовища, посуд, дистильовану воду, інструменти?

3. Як відбувається стерилізація приміщення лабораторії?

3. Різноманітність і приготування поживних середовищ

3.1. Типи поживних середовищ і огляд їх складів

Залежно від виду рослин необхідно відчувати як тверді (щільних), так і рідкі поживні середовища. Іноді рідкі середовища мають перевагу, тому що забезпечують більшу рухливість трофічних елементів. Наприклад, при розмноженні троянд більш успішним було культивування пагонів на двошарової живильному середовищі: нижній шар - щільних, верхній - рідкий. На ефективність розмноження можуть також впливати розташування експлантов (горизонтальне або вертикальне), тип пробок (ватяні, пластмасові, скляні, металеві і т.д.), а також співвідношення обсягу експлантов і кількості живильного середовища для оптимального освітлення і газообміну експлантов.

Склад живильного середовища необхідно підбирати для кожного виду рослин. На мікроклональне розмноження впливають гормони, мінеральні солі, вітаміни і вуглеводи. При розмноженні in vitro часто використовують середовища Мурасіге і Скуга, Гамборга, Хеллера і інші. Зазвичай використовують середу Мурасіге-Скуга (MS), яка містить багато неорганічного азоту, що стимулює процеси органогенезу і соматичного ембріогенезу. Питання оптимального співвідношення NH5 - NO3 залишається відкритим, так як літературні дані досить суперечливі і універсального рецепта для всіх видів рослин немає. Як джерело вуглецевого живлення використовують різні вуглеводи типу сахарози, глюкози, фруктози, галактози. Різні культури вимагають різної концентрації вуглеводів на різних етапах мікроклонального розмноження.

Компоненти середовища для вирощування рослинних клітин і тканин можна розділити на 6 основних груп, що зазвичай відображає порядок приготування концентрованих маткових розчинів: макроелементи, мікроелементи, джерела заліза, вітаміни, джерела вуглецю, фітогормони.

Основою для всіх поживних середовищ для культивування рослинних експлантів є суміш мінеральних солей. Це сполуки азоту у вигляді нітратів, нітритів, солей амонію; фосфору - у вигляді фосфатів; сірки - у вигляді сульфатів; а також розчинних солей К +, Na +, Са ++, Мg ++. Залізо використовується у вигляді хелатів [FeО4 або Fe2O4 + ЕДТА (етилендіамінтетраоцтової кислоти) або її натрієва сіль Na ЕДТА (трилон Б)] - найбільш доступній формі для засвоєння рослинними тканинами.

Азот, фосфор, сірка входять до складу органічних сполук: білків, жирів, нуклеїнових кислот. Залізо, цинк, марганець, молібден, кобальт в поєднанні з порфиринами утворюють макромолекули пігментів фотосинтезу (хлорофілу), окислювально-відновних ферментів (каталази, пероксидази, поліфенолоксидази). Отже, всі ці сполуки виконують в клітинах і тканинах структурну функцію. У той же час іони К +, Na +, Са ++, Cl -, Н + необхідні для регуляції pH середовища і підтримки фізіологічних градієнтів клітин (тургору, осмотичного тиску, полярності).

Як джерело вуглецю для біологічних макромолекул, а також при культивуванні гетеротрофних тканин (каллусов і суспензій) в поживні середовища додають вуглеводи в концентрації 20-60 г / л. Зазвичай це дисахариди (сахароза), моносахариди (гексози: глюкоза і фруктоза, пентози: ксилоза та інші). Полісахариди в поживних середовищах практично не використовуються. Тільки деякі типи тканин (пухлинні), що містять гідролітичні ферменти, вирощують на середовищах з крохмалем, рафіноза, целлобіоза.

Для стимуляції біохімічних реакцій в клітці використовують биологиче-ські каталізатори - вітаміни групи В (В1, В6, В12), С (аскорбінову кислоту), РР (нікотинову кислоту), мезоінозіт.

Тіамін (В1) входить до складу піруватдекарбоксилази, бере участь в перетвореннях вуглеводів. Тіамінпірофосфат входить до складу ферментів окисного декарбоксилювання кетокислот (піровиноградної і кетоглутаровой), є коферментом транскетолази.

Піридоксин (В6) у вигляді фосфорнркіслого ефіру входить до складу ферментів декарбоксилирования і переамінування амінокислот.

Нікотинова кислота (РР) у вигляді аміду входить до складу дегідрогеназ НАД і НАДФ, які каталізують донорно-акцепторні ланцюг Н + (відібрання Н + від молекул органічних речовин).

Для управління процесами формоутворення в культурі тканин необхідні біологічні регулятори росту і розвитку - фітогормони. Ці речовини впливають на диференціацію і дедиференціації клітин і тканин, ініціюють гистогенез, індукують поділ і розтягнення клітин, беруть участь в процесах старіння і дозрівання, або стимулюють, або пригнічують ріст і розвиток клітинних культур, обумовлюють формування статі. У біотехнологічних дослідженнях частіше використовують гормони, що стимулюють ріст і розвиток: ауксини, цитокініни, гібереліни.

Ауксини: ІУК - индолил-3-оцтова кислота, ІМК - индолил-3-масляна кислота, НУК - нафтілуксусная кислота, 2,4-Д - 2,4-діхлорфеноксі-оцтова кислота.

Цитокініни: кинетин - 6-фурфуріламінопурін, зеатин, NN-дифеніл-сечовина, 6-БАП - 6-бензіламінопурін.

Гібереліни: гіберрелловая кислота.

Як біологічних добавок для індукції первинного каллуса можна використовувати рослинні екстракти (10-15% від загального обсягу середовища): кокосове молоко (рідкий ендосперм кокосового горіха), витяжки з незрілих зернівок кукурудзи (краще в період молочної стиглості), які містять цитокініни - кинетин і зеатин (6-ти заміщені амінопуріна) і NN-діфенілмочевіна.

У культурі in vitro застосовують рідкі і щільних (тверді) середовища. Рідкі середовища використовуються для культивування суспензій, каллусов, ізольованих органів і тканин, рослин-регенерантів. При цьому для підтримки експлантов в пробірки з середовищем поміщають спеціальні містки-підтримки з фільтрувального паперу або синтетичних пористих матеріалів.

Щільних середовища готують на основі агар-агар - полісахариду, що входить до складу морських водоростей, який утворює з водою гель при pH 5,6-6,0. Іноді в якості ущільнювача і замінника агар-агар використовують поліакриламідні гелі (біогелі) P10 і P200.

Для штучних поживних середовищ розчини макро- і мікросолей готують заздалегідь і використовують багаторазово. Це маткові (концентровані) розчини. Їх зберігають у спеціальних умовах: макро- і мікросолі в холодильнику в судинах з притертими пробками при 0 ... + 4 ° С; вітаміни, фітогормони, ферменти, рослинні екстракти - при -20 ° С в невеликих по 5-10 мл судинах з пробками (пеніцилової флакони).

Маткові розчини макросолей зазвичай перевершують робочі по концентрації в 10-40 разів, мікросолей - в 100-1000 разів, вітамінів - в 1000 разів.

Розчини фітогормонів бажано готувати безпосередньо перед роботою із середовищами.

Для приготування маточного розчину макро- і мікросолей кожну сіль розчиняють в окремому стаканчику при нагріванні, потім зливають і доводять до потрібного обсягу. В охолоджену суміш мікросолей останнім додають розчин солей молібдену, а в макросолі - розчин солей магнію (для запобігання випаданню осаду).

Маткові розчини хлористого кальцію і хелати заліза (сірчанокисле залізо + ЕДТА, або Na ЕДТА - трилон Б) готують і зберігають окремо від інших солей.

Концентровані розчини вітамінів готують наступним чином: 10-кратні навішування розчиняють в 10 мл дистильованої води кожен окремо.

Фітогормони - це речовини, які погано розчиняються у воді. Тому попередньо 100 мг речовини розчиняють в невеликих кількостях (0,5-2,0 мл) спирту (ауксини, гібереліни), 0,5-1 н HCl або КОН (цитокініни), потім підігрівають до повного розчинення (крім абсцизовой кислоти і кинетина ) і доводять до 100 мл об'єму (1 мл містить 1 мг речовини).

Прописи основних поживних середовищ використовуваних при мікроклонального розмноження рослин

по сучасним технологічним комплексам в машинобудуванні. Викладено основні положення федерального освітнього стандарту за напрямом підготовки 220700, кваліфікація (ступінь) - бакалавр.

Основна освітня програма

дисципліни формування у студентів загальнокультурних компетенцій, визначених основнойобразовательнойпрограммойпо напрямку 020400 .62 «Біологія» кваліфікації "бакалавр. цикл Учебнаядісціпліна« Ботаніка »Мета вивчення дисципліни сформувати.

151000.62 Технологічні машини і обладнання. Профіль підготовки «Машини і апарати харчових виробництв». Кваліфікація (ступінь) випускника - бакалавр.

Особливості роботи в умовах стерильної лабораторії

Схожі статті