Мікроклональне розмноження рослин.
Мікроклональне розмноження рослин - один із способів вегетативного розмноження в умовах «in vitro»
Для насіннєвих рослин характерно два способу розмноження: насіннєвий і вегетативний. Обидва ці способи мають як переваги, так і недоліки. До недоліків насіннєвого розмноження слід віднести, в першу чергу, генетичну строкатість одержуваного посадкового матеріалa і тривалість ювенільного періоду. При вегетативному розмноженні зберігається генотип материнської рослини і скорочується тривалість ювенільного періоду. Однак для більшості видів (в першу чергу для деревних порід) проблема вегетативного розмноження залишається до кінця не вирішеною.
Це обумовлено наступними причинами:
- не всі породи, навіть на ювенільної стадії, можуть розмножуватися вегетативним способом з необхідною ефективністю (дуб, сосна, ялина, горіхоплідні та ін.);
- практично неможливо за допомогою живцювання розмножувати багато видів деревних порід у віці старше 10-15 років;
- не завжди вдається отримувати стандартний посадковий матеріал (можливість накопичення і передачі інфекції);
- трудомісткістю і складністю операцій при розмноженні дорослих (деревних) рослин за допомогою щеплень;
- неефективністю розроблених технологій для отримання достатньої кількості генетично однорідного матеріалу протягом року.
Досягнення в галузі культури клітин і тканин привели до створення принципово нового методу вегетативного розмноження - клонального мікророзмноження (отримання в умовах in vitro (у пробірці), нестатевим шляхом рослин, генетично ідентичних вихідному примірнику). В основі методу лежить унікальна здатність рослинної клітини реалізовувати властиву їй тотипотентність, тобто під впливом екзогенних впливів давати початок цілому рослинному організму.
Цей метод, безсумнівно, має ряд переваг перед існуючими традиційними способами розмноження:
- отримання генетично однорідного посадкового матеріалу;
звільнення рослин від вірусів за рахунок використання меристемних культури;
- високий коефіцієнт розмноження (105-106 - для трав'янистих, квіткових рослин, 104-105 - для чагарникових деревних, 104 - для хвойних);
- скорочення тривалості селекційного процесу;
- прискорення переходу рослин від ювенільної до репродуктивної фазі розвитку;
- розмноження рослин, важко розмножуються традиційними способами;
- можливість проведення робіт протягом року і економія площ, необхідних для вирощування посадкового матеріалу;
Перші досягнення в області клонального мікророзмноження були отримані в кінці 50-х років XX століття французьким вченим Жоржем Морелем, якому вдалося отримати перші рослини-регенеранти орхідей. Успіху Ж. Мореля в мікророзмноження сприяла вже розроблена на той час техніка культивування апікальної меристеми рослин в умовах in vitro. Як правило, дослідники в якості первинного експлантов використовували верхівкові меристеми трав'янистих рослин: гвоздики, хризантеми, соняшнику, гороху, кукурудзи, кульбаби, салату і вивчали вплив складу живильного середовища на процеси регенерації і формування рослин. Ж. Морель в своїх роботах також використовував верхівку цимбидиума (сем. Орхідні) складається з конуса наростання і двох-трьох листових зачатків, з якої за певних умов спостерігав утворення сферичних сфер - протокормов. Сформовані протокорми можна було ділити і потім культивувати самостійно на знову приготовленої живильному середовищі до утворення листових примордіїв і коренів. В результаті їм було виявлено, що цей процес нескінченний і можна було отримувати у великій кількості високоякісний і генетично однорідний, безвірусний посадковий матеріал.
У Росії роботи по клональне мікророзмноження були розпочаті в 60-х роках в лабораторії культури тканин і морфогенезу Інституту фізіології рослин ім. К. А. Тімірязєва РАН. Під керівництвом чл.-кор. РАН, академіка РАСГН Бутенко Р. Г. були вивчені умови мікророзмноження картоплі, цукрових буряків, гвоздики, гербери, фрезії і деяких інших рослин і запропоновані промислові технології. Таким чином, перші успіхи в клональне мікророзмноження пов'язані з культивуванням апікальних меристем трав'янистих рослин на відповідних поживних середовищах, що забезпечують в кінцевому підсумку отримання рослин-регенерантів.
Однак область застосування мікророзмноження різноманітна і має тенденцію до постійного розширення. Це в першу чергу відноситься до розмноження in vitro дорослих деревних порід, особливо хвойних, і використання техніки in vitro для збереження рідкісних і зникаючих видів лікарських рослин. В даний час в цьому напрямку намітився позитивний зсув.
Етапи мікроклонального розмноження рослин.
Процес клонального мікророзмноження можна розділити на 4 етапи:
1. Вибір рослини-донора, ізолювання експлантів і отримання добре зростаючої стерильною культури.
2. Власне мікророзмноження, коли досягається отримання максимальної кількості меристематических клонів.
3. Укорінення розмножених пагонів з наступною адаптацією їх до ґрунтових умов, а при необхідності депонування рослин-регенерантів при зниженій температурі (+ 2оС, + 10оС).
4. Вирощування рослин в умовах теплиці та підготовка їх до реалізації або посадці в поле.
Для культивування тканин на кожному з чотирьох етапів потрібне застосування певного складу живильного середовища.
На першому етапі необхідно домогтися отримання добре зростаючої стерильною культури. У тих випадках, коли важко отримати вихідну стерильну культуру експлантов, рекомендується вводити до складу живильного середовища антибіотики (тетрациклін, пеніцилін та ін.) В концентрації 100-200 мг / л. Це в першу чергу відноситься до деревних рослин, у яких спостерігається тенденція до накопичення внутрішньої інфекції.
На першому етапі, як правило, використовують середу, що містить мінеральні солі за рецептом Мурасіге і Скуга, а також різні біологічно активні речовини і стимулятори росту (ауксини, цитокініни) в різних поєднаннях в залежності від об'єкта. У тих випадках, коли спостерігається інгібування росту первинного експлантов, за рахунок виділення їм в живильне середовище токсичних речовин (фенолів, терпенів і інших вторинних з'єднань), зняти його можна, використовуючи антиоксиданти. Це можливо двома способами: або омивкой експлантов слабким його розчином протягом 4-24 год, або безпосереднім додаванням в живильне середовище. В якості антиоксидантів використовують: аскорбінову кислоту (1 мг / л), глютатіон (4-5 мг / л), дітіотріетол (1-3 мг / л), діетілдітіокарбомат (2-5 мг / л), полівінілпіролідон (5000-10000 мг / л). У деяких випадках доцільно додавати в живильне середовище адсорбент - деревне активоване вугілля в концентрації 0,5-1%. Тривалість першого етапу може коливатися від 1 до 2 місяців, в результаті якого спостерігається зростання меристематичних тканин і формування первинних пагонів.
2 етап - власне мікророзмноження. На цьому етапі необхідно домогтися отримання максимальної кількості меріклонов, враховуючи при цьому, що зі збільшенням субкультівірованія збільшується число рослин-регенерантів з ненормальною морфологією і можливо спостерігати утворення рослин-мутантів.
Як і на першому етапі, використовують живильне середовище за рецептом Мурасіге і Скуга, що містить різні біологічно активні речовини, а також регулятори росту. Основну роль при підборі оптимальних умов культивування експлантів грають співвідношення і концентрація внесених в живильне середовище цитокінінів і ауксинів. З цитокінінів найбільш часто використовують БАП в концентраціях від 1 до 10 мг / л, а з ауксинов-ІУК і НУК в концентраціях до 0,5 мг / л.
3 і 4 етапи - укорінення мікропобегов, їх подальша адаптація до ґрунтових умов і висадка в поле є найбільш трудомісткими етапами, від яких залежить успіх клонального мікророзмноження. На третьому етапі, як правило, змінюють основний склад середовища: зменшують в два, а іноді і в чотири рази концентрацію мінеральних солей за рецептом Мурасіге і Скуга або замінюють її середовищем Уайта, зменшують кількість цукру до 0,5-1% і повністю виключають цитокиніни , залишаючи один лише ауксин. Як стимулятор коренеутворення використовують β-індол-3-масляну кислоту (ІМК), ІУК або НУК.
Укорінення мікропобегов проводять двома способами:
1) витримування мікропобегов протягом декількох годин (2-24 год) в стерильному концентрованому розчині ауксина (20-50 мг / л) і подальше їх культивування на агаризованому середовищі без гормонів або безпосередньо в потрібному грунтовому субстраті (імпульсна обробка);
2) безпосереднє культивування мікропобегов протягом 3-4 тижнів на живильному середовищі, що містить ауксин в низьких концентраціях (1-5 мг / л в залежності від досліджуваного об'єкта). Останнім часом запропонований метод вкорінення пробіркових рослин в умовах гідропоніки. Цей метод дозволяє значно спростити етап вкорінення і одночасно отримувати рослини, адаптовані до природних умов. Для картоплі можливо використовувати безсубстратную гідропоніку для отримання міні-бульб. Затінення нижньої частини культуральних судин щільною чорною матерією або додавання в живильне середовище активованого вугілля сприяє укоріненню мікропобегов.
Пересадка рослин-регенерантів в субстрат є відповідальним етапом, завершальним процес клонального мікророзмноження. Найбільш сприятливий час для пересадки пробіркових рослин - весна або початок літа.
Рослини з двома-трьома листами й добре розвиненою кореневою системою обережно виймають з колб або пробірок пінцетом з довгими кінцями або спеціальним гачком. Коріння відмивають від залишків агару і висаджують в грунтовий субстрат, попередньо простерилізувати при 85-90 ° С протягом 1-2 год. Для більшості рослин в якості субстратів використовують торф, пісок (3: 1); торф, дернову грунт, перліт (1: 1: 1); торф, пісок, перліт (1: 1: 1). Виняток становлять сімейство орхідних, для яких готують субстрат, що складається з сфагнового моху, суміші торфу, листя бука або дуба, соснової кори (1: 1: 1).
Приготованим заздалегідь грунтовим субстратом заповнюють пікірувальні ящики або торф'яні горщики, в яких вирощують рослини-регенеранти. Горщики з рослинами поміщають в теплиці з регульованим температурним режимом (20-22 ° С), освітленістю не більше 5 тис. Лк і вологістю 65-90%. Для кращого росту рослин створюють умови штучного туману. У тих випадках, коли немає можливості створити такі умови, горщики з рослинами накривають скляними банками або поліетиленовими пакетами, які поступово відкривають до повної адаптації рослин.
Через 20-30 днів після посадки добре вкорінені рослини підживлюють розчинами мінеральних солей Кнудсон, Мурасіге і Скуга, Чеснокова, Кнопа (в залежності від виду рослин) або комплексним мінеральним добривом. У міру росту рослин їх розсаджують в великі ємності зі свіжим субстратом. Подальше вирощування акліматизованих рослин відповідає прийнятій агротехніці вирощування для кожного індивідуального виду рослин.
Процес адаптації пробіркових рослин до ґрунтових умов є найбільш дорогої і трудомісткою операцією. Нерідко після пересадки рослин в грунт спостерігається зупинка в рості, опадання листя і загибель рослин. Ці явища пов'язані, в першу чергу, з тим, що у пробіркових рослин порушена діяльність устьічного апарату, внаслідок чого відбувається втрата великої кількості води. По-друге, у деяких рослин в умовах in vitro не відбувається утворення кореневих волосків, що призводить, в свою чергу, спричиняє порушення поглинання води і мінеральних солей з грунту. Тому доцільно на третьому або четвертому етапах клонального мікророзмноження застосовувати штучну мікорізацію рослин (для мікотрофності), з огляду на їх позитивну роль в постачанні рослин мінеральними і органічними поживними речовинами, водою, біологічно активними речовинами, а також в захисті рослин від патогенів.
Індійськими вченими запропонований простий метод запобігання швидкого зневоднення листя рослин, вирощених in vitro, під час їх пересадки в польові умови. Метод полягає в тому, що листя протягом усього акклиматизационного періоду слід обприскувати 50% -ним водним розчином гліцерину або сумішшю парафіну, або жиру в діетиловому ефірі (1: 1). Застосування цього методу допомагає уникнути довгих і скрутних процесів загартовування пробіркових рослин і забезпечує 100% -ву їх приживлюваність.
Методи клонального мікророзмноження.
Існує багато методів клонального мікророзмноження, а також різних їх класифікацій. Згідно з однією з них, запропонованої Мурасіге в 1977 році, процес можна здійснювати наступними шляхами:
1. Активація пазушних меристем.
2. Освіта адвентивних пагонів тканинами експлантов.
3. Виникнення адвентивних пагонів в каллусе.
4. Індукція соматичного ембріогенезу в клітинах експлантов.
5. Соматичний ембріогенез в калусних тканини.
6. Формування придаткових ембріоїдів в тканини первинних соматичних зародків (розподіл первинних ембріоїдів).
Н. В. Катаєва та Р. Г. Бутенко (1983) виділяють два принципово різних типи клонального мікророзмноження:
1. Активація вже існуючих в рослині меристем (апекс стебла, пазухи і сплячі бруньки стебла).
2. Індукція виникнення нирок або ембріоїдів de novo:
а) утворення адвентивних пагонів безпосередньо тканинами експлантов;
б) індукція соматичного ембріогенезу;
в) диференціація адвентивних бруньок в первинної та пересадковою калусних тканини.
Основний метод, який використовується при клональне мікророзмноження рослин - активація розвитку вже існуючих в рослині меристем. Він заснований на знятті апикального домінування.
Цього можна досягти двома шляхами: а) видаленням верхівкової меристеми стебла і подальшим мікрочеренкованіем втечі in vitro на безгормонального середовищі; б) додаванням в живильне середовище речовин цитокініновою типу дії, які індукують розвиток численних пазушних пагонів. Як правило, в якості цитокінінів використовують 6-бензіламінопурін (БАП) або 6-фурфуріламінопурін (кинетин) і зеатин.
Отримані таким чином пагони відділяють від первинного експлантов і знову самостійно культивують на свежеприготовленной живильному середовищі, що стимулює проліферацію пазушних меристем і виникнення пагонів більш високих порядків.
Часто в якості експлантів використовують верхівкові або пазушні бруньки, які ізолюють з втечі і поміщають на поживне середовище з цитокининами.
Утворені пучки пагонів ділять, при необхідності черенкуют і переносять на свіже живильне середовище. Після декількох пасажів, додаючи в живильне середовище ауксини, пагони укорінюють in vitro, а потім переносять в грунт, де створюють умови, що сприяють адаптації рослин.
Адаптація пробіркових троянд до ґрунтових умов.
В даний час цей метод широко використовується у виробництві посадкового матеріалу сільськогосподарських культур, як технічних, так і овочевих, а також для розмноження культур промислового квітництва (наприклад, гвоздики), тропічних і субтропічних рослин, плодових і ягідних культур, деревних рослин.
