Мета заняття. Ознайомити студентів з властивостями збудників-лей і лабораторною діагностикою сапу, меліоїдоза, псевдомоноза норок і біопрепаратами.
Устаткування і матеріали. Культури P. aeruginosa на МПА в чашках Петрі, в МПБ, набір тестів, що характеризують фермен-татівние властивості P. aeruginosa. покривні скла для препарату «роздавлена крапля», біопрепарати для специфічної профілактики і діагностики сапу і псевдомоноза норок.
Сап. Це інфекційна, хронічно протікає хвороба однокопитних тварин (коні, осли, мули, ослиці); вос-пріімчіви представники сімейства котячих і людина. Характеризується виникненням в легких, на слизовій оболонці носа і різних ділянках шкіри специфічних вузликів, схил-них до розпаду з утворенням гнійних виразок.
Збудник сапу - бактерія Pseudomonas mallei, рід Pseudomonas, сімейство Pseudomonadaceae.
Лабораторна діагностика сапу заснована на результатах сіро-логічних досліджень (РСК); бактеріологічне досліджень-ня проводять у виняткових випадках.
Бактеріологічне дослідження вклю-чає в себе виявлення збудника у вихідному матеріалі ме-тодом світлової мікроскопії та біопроби, виділення чистої культури посівом на поживні середовища та ідентифікацію збудника по культурально-морфологічним і ферментативним властивостями.
Матеріал для дослідження. У лабораторію направляють кров, гнійне виділення виразок, носові виділення, пунктат лімфаті-чеських вузлів, гній з абсцесів; від убитих тварин беруть учас-тки ураженої тканини легенів, печінки, селезінки, лімфатічес-ких вузлів, носової перегородки, трахеї, бронхів і ін.
Мікроскопія препаратів з вихідного матеріалу. В мазках з матеріалу, забарвлених по Граму, збудник виявляють у вигляді прямих або злегка вигнутих, із закругленими кінцями грамнегативних паличковидних бактерій розміром (1,4. 4) х 0,5 мкм, без суперечка і капсул (рис. 108). При фарбуванні метиленовим синім Леффлера в клітинах видно зернистість.
Виділення та ідентифікація культури збудника. Збудник сапу -аероб, температурний оптимум 37. 38 ° С, рН 6,8. 7, промінь-ше зростає на середовищах з додаванням гліцерину (2. 4%). Досліджуючи-мий матеріал висівають на гліцерінізірованних МПА і в МПБ. Зростання збудника з'являється на першу-другу добу, іноді пізніше.
У МПБ збудник росте з помутнінням середовища, на дні про-бирки утворюється сіро-білий слизовий осад, на поверхні бульйону може з'являтися плівка. На МПА збудник форми-рілої гладкі, напівпрозорі, сірувато-білі, з перламутровим відтінком колонії, що поступово зливаються в слизовий наліт. З вирослих культур роблять мазки, фарбують за Грамом, при мікроскопії виявляють грамнегативні поліморфні палички; в бульйонних культурах клітини збудника коротше - аж до коккоподібних.
Характерним вважають зростання на гліцериновому картоплі: через дві - три доби з'являються дрібні, напівпрозорі, з Желтова-тим відтінком колонії, які потім зливаються в наліт з жел-Товаті відтінком ( «медовим»), до шостого-восьмого дня колір змінюється до буро коричневого або червонуватого.
У бактерій з типовими для збудника сапу культурально-морфологічними властивостями вивчають ферментативні при-знаки. P. mallei повільно, на 6. 8-у добу, згортає молоко, розріджує желатину, розщеплює з утворенням кислоти без газу глюкозу, лактозу, що не утилізує сахарозу, мальтозу, ман-ніт. У країнах тропічної зони Південно-Східної Азії виділити-ють збудника «помилкового сапу» (меліоїдоза, хвороби Уітмор) - P. pseudomallei. що викликає захворювання людини і жи-Вотня. Для диференціації P. mallei і P. pseudomallei использу-ють ознаки, зазначені в таблиці 32.
Біопроба. Готують тканинну суспензію на стерильному фізіо- логічному розчині (співвідношення 1:10) і вводять в обсязі 0,5. 1 мл підшкірно в область шиї золотистим хом'якам або в обсязі 3. 5 мл морським свинкам. Стерильно взятим матеріалом (пунктат) заражають тварин внутрибрюшинно. У позитивними-них випадках на місці підшкірної ін'єкції утворюється виразка з уп-лотненнимі краями, розвивається кон'юнктивіт, риніт, у зара-дені внутрибрюшинно самців морських свинок - орхіт (фе-номен Штрауса). Загибель хом'ячків настає на 5. 7-у добу, морських свинок - на 8. 15-у добу або ж хвороба переходить в хронічну форму. Полеглих і убитих тварин піддають бактеріологічному дослідженню.
Серологічна діагностика заснована на ре-результатах РСК. Діагностичним титром сироватки вважають раз-ведення 1:10 при затримці гемолізу на чотири або три хрести; затримку гемолізу на один, два хрести при розведенні сироватки 1. 10 і на три, чотири хрести при розведенні сироватки 1: 5 оцінюють як сумнівний результат.
Алергічна діагностика. Метод, застосовуваний в господарствах для контролю за благополуччям коней по сапу (ставлять офтальмопробу або внутрішньошкірної проби з малеїном).
Біопрепарати. Малеїн - діагностичний сапной аллер-ген. При його виготовленні вирощують культуру збудника в гліцерінізірованном бульйоні протягом чотирьох місяців, стерилізують в автоклаві, фільтрують через фільтр Зейтца, контролюють на стерильність, нешкідливість на білих мишах, специфічність - на здорових конях, стандартизує-ють по активності в одиницях дії на лабораторних жи-Вотня .
Сапной антиген для РСК готують наступним чином: агар-ву культуру збудника змивають фенолізірованним физиоло-гическим розчином, стерилізують в автоклаві, відстоювання ють. В якості антигену використовують вільну від клітин культу-ральную рідина, перевірену на стерильність, специфічний-ність і активність.
Позитивна сапние сироватка призначена для визначенні-ня активності антигену (РСК) і в якості контролю при по-становке РСК. Отримують гипериммунизации коней.
Мелиоидоз (помилковий сап, хвороба Уітмор). Інфекційне за-болевания тварин (коні, собаки, кролики, дрібна рогата худоба) і людини, що протікає у формі гострої або хронічної септицемії або септикопіємії.
Збудник - бактерія Pseudomonas pseudomallei, рід Pseudomonas. сімейство Pseudomonadaceae.
Лабораторна діагностика меліоїдоза заснована на результатах бактеріологічного дослідження.
Бактеріологічне дослідження вклю-чає в себе виявлення збудника у вихідному матеріалі ме-тодом світлової мікроскопії та біопроби, виділення чистої культури посівом на поживні середовища та ідентифікацію збудника по культурально-морфологічним, ферментативним і серологічним властивостям.
Матеріал для дослідження. У лабораторію направляють кров, мокротиння, сечу, гнійне виділення з абсцесів, ділянки пора-дені органів.
Мікроскопія препаратів з вихідного матеріалу. Збудник являє собою полиморфную грамотрицательную паличку розміром (1,5. 6) х (9,5. 10) мкм, із закругленими кінцями, суперечка і капсул немає; лофотріх. У мазках-відбитках з органів розташовується поодиноко або компактними скупченнями.
Виділення та ідентифікація культури збудника. Збудник - аероб, температурний оптимум 37 ºС, рН 6,8. 7,0, до живильних середовищ невимогливий. Досліджуваний матеріал висівають на агар і в бульйон з гліцерином. При забрудненні матеріалу сторонньої мікрофлорою його обробляють пеніциліном (1000 ОД / мл).
На щільних середовищах через 24 год інкубування збудник формує дрібні, прозорі, пізніше мутнеющего білуваті колонії з металевим блиском, можуть з'являтися колонії Я-форми і великі (до 7 мм) М-форми. На кров'яному агарі, гліцерінізірованних середовищах росте з утворенням колоній кремово-помаранчевого кольору. На рідких середовищах через 24. 48 год ви-викликають помутніння середовища, освіта плівки, яка після додавання нейтрального червоного набуває оранжево-крас-ний колір. Для бульйонних культур характерний затхлий запах. Збудник в мазках з чистих культур розташовується поодиноко, па-рами, короткими ланцюжками або скупченнями по 5. 7 штук.
У культур з типовими для P. pseudomallei культурально-морфологічними ознаками досліджують ферментативні свій-ства. Збудник ферментує з утворенням кислоти глюко-зу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, дульцит; декстрин, не утворює індол і сірководень, повільно розріджує желатину, згортає і пептонізірует молоко, гидролизует аргінін.
Виділені культури також ідентифікують в серологічес-ких реакціях: РА, РНГА, РП.
Біопроба. Суспензією з матеріалу заражають внутрішньочеревно-но (0,5. 1,0 мл) щурів і морських свинок. В позитивних випад-ях тварини гинуть в залежності від вірулентності штаму на 3. 15-ту добу. У самців морських свинок може розвинутися фе-номен Штрауса.
В якості ознак для диференціації P. mallei і P. pseudomallei використовують морфологічні критерії (див. Табл.32), а також здатність P.pseudomallei синтезувати на кров'яному агарі кремово-помаранчевий пігмент, пептонізіровать молоко, гідролізувати желатину, при зараженні викликати ги-бель щурів.
Псевдомоноз норок. Гостро протікає інфекційне захво-рювання. Характеризується геморагічної пневмонією, призна- ками сепсису. Крім норок сприйнятливі лисиці, песці; у жи-Вотня інших видів збудник може служити причиною пнев-моній, післяпологових, постхірургіческіе ускладнень.
Збудник псевдомоноза норок - бактерія Pseudomonas aeruginosa, рід Pseudomonas, сімейство Pseudomonadaceae.
Лабораторна діагностика псевдомоноза норок заснована на ре-результатах бактеріологічного дослідження.
Бактеріологічне дослідження вклю-чає в себе виявлення збудника у вихідному матеріалі ме-тодом світлової мікроскопії, виділення чистої культури посе-вом на поживні середовища та ідентифікацію збудника по культурально-морфологічним, ферментативним і серологію-ного властивостями.
Матеріал для дослідження. У лабораторію направляють пора-женние ділянки легких, регіонарні лімфатичні вузли, селі-Зенко, печінку, нирки.
Мікроскопія препаратів з вихідного матеріалу. P. aeruginosa в мазках, пофарбованих за Грамом, виявляють в формі прямих або вигнутих грамнегативних паличок довжиною 0,5. 1,4 мкм, шириною 0,2. 0,4 мкм, без капсул і спор; утворює джгутики. Рас-покладається у вигляді поодиноких клітин, коротких ланцюжків.
Виділення та ідентифікація культури збудника. Возбуди-тель - аероб, температурний оптимум 35. 37 ° С, до живильних середовищ невимогливий. Досліджуваний матеріал висівають на МПА, в МПБ.
Через 24 год зростання P. aeruginosa в МПБ проявляється помутнілось-ням середовища, утворенням поверхневої плівки і сірувато-білого осаду, за рахунок пігменту середу пофарбована в синьо-зелений колір, у міру старіння культури колір колоній стає бурим. На МПА збудник формує в основному два типи колоній: великі (діаметр 2. 5 мм), напівпрозорі, сіруваті, гладкі, з плоскими краями і піднятим центром, а також дрібні шорсткі. Штами, виділені з респіра-торного і сечостатевого тракту, можуть утворювати слизові колонії. Середовище навколо колоній пофарбована за рахунок пігменту в синьо-зелений колір. Збудник синтезує чотири типи піг-мента: піоціанін (синьо-зелений або жовто-зелений), флуо-ресцеін, піорубін і чорно-бурий пігмент. Для культівірова-ня P. aeruginosa при первинній ізоляції з досліджуваного ма-териала використовують спеціальні селективні середовища з анти-антибіотиками.
У виділених культур вивчають ферментативні властивості. Для P. aeruginosa характерні такі ознаки: освіта аргініндігідролази, оксидази, гідроліз желатину, розщеплюючи-ня глюкози, бета-аланіну, D-, L-аспарагіну, денітрифікація і здатність до зростання при 4l ° С.
Вид гетерогенний по соматичним О-антигенів. Для иденти-ції на рівні О-серогрупи використовують РА на склі, причому досліджують тільки культури, у яких відзначені міні-мум два з трьох фізіологічних ознак, характерних для виду: утворення пігменту піоціанін, розщеплення глюко-зи, зростання при 41. 42 ° С. Використовують набір з трьох полівалент-них і одинадцяти моновалентних сироваток. Антигеном слу-жит 18. 20-годинна агарових культур P. aeruginosa. інактивована кип'ятінням в водяній бані протягом 1,5 год [концентра-ція (3. 5) * 10 9 / мл]. Антиген спочатку досліджують з полівалентними сироватками, при отриманні позитивного результату - з моновалентною, що входять до складу тієї чи іншої полівалентної сироватки. Результат враховують через 3. 6 хв.
Біопрепарати. Моновалентну формолквасцовую вакцину проти псевдомоноза норок готують наступним чином: культу-ру вакцинного штаму (Шостий серотип) вирощують на пита-тельной середовищі, інактивують формаліном, адсорбують на квасцах, контролюють на стерильність, нешкідливість, актив-ність.
Діагностичні О-агглютинирующие сироватки для сіро-групової ідентифікації P. aeruginosa включають в себе три по-лівалентние сироватки: № 1 (03, 04, 05, 06, 07), № 2 (02, 08, 09), № 3 (010 , 011, 012) і одинадцять відповідних моновалент-них сироваток. Призначені для ідентифікації P. aeruginosa на рівні О-серогрупи.
ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ
1. Ознайомитися з біопрепаратами для серологічної і ал-лергіческой діагностики сапу.
2. Вивчити морфологічні, тинкторіальних, культуральні і ферментативні властивості P. aeruginosa.
3. Ознайомитися з біопрепаратами для специфічної про- профілактику і діагностики псевдомоноза норок.
1. Яке значення бактеріологічного дослідження для лабораторної діагностики сапу?
2. Які імунологічні методи застосовують для діагностики сапу?
3. Які біологічні властивості збудника псевдомоноза норок?
4. Які біопрепарати застосовують для специфічної профілактики псевдомоноза норок і серологічної ідентифікації збудника?
5. У чому полягає бактеріологічне дослідження на мелиоидоз?