Калусних тканину - один з видів клітинної диференціювання, виникає шляхом неорганізованої проліферації дедіфференцірованних клітин органів рослини. У рослин в природі калусних тканину виникає у виняткових обставинах (наприклад, при травмах) і функціонує нетривалий час. Ця тканина захищає місце поранених, може накопичувати поживні речовини для анатомічної регенерації або регенерації втраченого органу.
Освіта каллуса не завжди пов'язане з травматичним впливом. Каллус може виникнути і в результаті проліферації внутрішніх тканин експлантов без зв'язку з поверхнею зрізу через порушення гормонального балансу. Зростаючий каллус розриває шари тканини і розвивається на поверхні. Для отримання культивованих калусних клітин фрагменти тканин різних органів вищих рослин - коренів, листя, стебел, пиляків, зародків (експланти) поміщають на штучне середовище, що містить ауксини, в пробірки, колби, чашки Петрі (in vitro).
Одними з найважливіших гормонів, що застосовуються при культивуванні in vitro, є ауксини, які активують розподіл і розтягнення клітин. Проникаючи в клітини, ІУК зв'язується зі специфічними рецепторами, впливаючи на функціональну активність мембран, рибосом і роботу ядерного апарату. Як ауксинов використовують 2,4-діхлорфеноксіуксусная кислоту (2,4-Д), нафтілуксусная кислоту (НУК), індол-масляну кислоту (ІМК), індолілуксусная кислоту (ІУК) в концентрації 0,5 - 10 мг / л, в залежності від виду експлантов.
Процесу освіти каллуса передує дедифференцировка тканин експлантов. При дедіфференціровка тканини втрачають структуру, характерну для їх специфічних функцій в рослині, і повертаються до стану клітин, які діляться. Якщо експлантов, який використовується для отримання каллуса, є фрагментом органу, то має в своєму складі епідермальні клітини, клітини камбію, судинної системи, серцевиною і первинної коровою паренхіми. Переважно пролиферируют клітини камбію, кори, серцевинною паренхіми.
Клітини в культурі можуть існувати в двох видах: у вигляді суспензії в рідкому поживному середовищі і на поверхні твердої живильного середовища у вигляді каллуса. Поверхневе культивування здійснюють на твердій агаризованому середовищі.
Калусних тканину, яку вирощують поверхневим способом, являє собою аморфну масу тонкостінних паренхімних клітин, що не має чітко визначеної анатомічної структури. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим, червоним. Залежно від походження і умов вирощування калусних тканини бувають:
- пухкі, сильно оводненности, легко розпадаються на окремі клітини;
- середньої щільності, з добре вираженими меристематические вогнищами;
- щільні, з зонами скороченої камбію і судин. Як правило, в тривалій культурі на середовищах, що містять ауксини, калусних тканини втрачають пігментацію і стають пухкими.
У циклі вирощування калусних тканини клітини після ряду поділів приступають до зростання розтягуванням, диференціюються як зріла калусних тканину і деградують. Для того, щоб не відбулося старіння, втрати здатності до поділу і подальшого зростання, а також відмирання калусних клітин, первинний каллус переносять на свіже живильне середовище через 28 - 30 днів, тобто проводять пасивування або субкультівірованія калусних тканини.
Виникнення фізіологічних і структурних відмінностей між клітинами і тканинами рослин, пов'язане з їх функціональною спеціалізацією, називають процесом диференціації. Поняття «диференціація» відображає перетворення ембріональної, меристематической клітини в спеціалізовану. Меристематические клітини, однотипні за структурою і функції, починають розвиватися різними шляхами, створюючи тканини різних органів.
Суспензійні культури - це поодинокі клітини, дрібні, середні і великі агрегати (групи клітин), що вирощуються в рідкому поживному середовищі при постійній аерації (доступ кисню) в асептичних умовах. Суспензії отримують з каллусов. Для ініціації суспензійний культури необхідно 2-3 г свіжої пухкої маси калусних клітин на 60-100 мл рідкого живильного середовища. Первинну суспензію культивують в колбах з рідким живильним середовищем на кругових гойдалках зі швидкістю 100-120 об. / Хв.
Суспензійні культури широко використовуються в якості модельних систем для вивчення шляхів вторинного метаболізму, індукції ферментів і експресії генів, деградації чужорідних сполук, цитологічних досліджень та ін.
Модельна крива зростання суспензії має S-подібну форму і включає: лаг-фазу, експонентну фазу, стаціонарну фазу і фазу деградації. Форма реальних ростових кривих відрізняється тривалістю фаз. Це залежить від генетики популяції, кількості інокулюму і складу живильного середовища. Швидкість наростання біомаси коливається від 15 до 70 діб.
Суспензії використовують для отримання важливих хімічних речовин: органічних кислот, ферментів, алкалоїдів, барвників, білків, амінокислот, які застосовуються в фармакології, парфумерії, харчової та хімічної промисловості, сільському господарстві.
Суспензійні культури мають велике значення для генетики і особливо молекулярної біології: з суспензійних клітин отримують протопластів, необхідні для соматичної гібридизації, генетичної інженерії, а також для вивчення метаболізму клітин.
Культивування рослинних клітин в рідкому поживному середовищі при постійному перемішуванні позбавлене багатьох недоліків, властивих культивування калусних клітин на щільних твердих середовищах. Постійний рух рослинних клітин в рідкому середовищі полегшує газовий обмін, вирішує проблеми поживного градієнта і полярності росту клітин. Більшість суспензійних культур можна отримати шляхом перенесення шматочків пухкого каллуса в перемішувати рідке середовище того ж складу, що і середовище, на якій вирощувався каллус. Для кожної лінії суспензійний культури клітин існує мінімальний розмір інокулюму (числа пересівати клітин), при меншому розмірі якого суспензійна культура клітин не росте. Зі зменшенням розміру інокулюму збільшується довжина лаг-фази. Суспензійні культури клітин рослин широко використовуються в якості модельних систем для вивчення шляхів вторинного метаболізму, індукції ферментів і експресії генів, а також як вихідний матеріал для виділення ферментів. Найважливішою їх перевагою при виділенні ферментів або продуктів вторинного метаболізму є відсутність у більшості суспензійних культур клітин хлорофілу і каротіноідних пігментів. У зв'язку з тим, що суспензійні культури клітин, в основному, складаються з відносно гомогенної популяції клітин, які можна швидко обробляти за допомогою додаються в середу культивування хімічних речовин, вони дуже зручні для біохімічних експериментів, що проводяться при дослідженні метаболізму уводімой речовин, а також для виділення і характеристики мутантів.
Мікроклональне розмноження пробіркових рослин здійснюють за допомогою живцювання. Таке розмноження засновано на придушенні апикального домінування і активації пазушних меристем при видаленні верхівки втечі. З пазушних бруньок на поживних середовищах утворюються пагони. Рослини, що сформували 5-6 листочків, в стерильних умовах витягують з пробірок і розрізають на частини (відрізок стебла з листом і пазушної ниркою). Живці висаджують на глибину междоузлия в поживні середовища або без гормонів, або з додаванням ауксинов.
Живці культивують в тих же умовах, що і меристеми: при температурі 24-25 о С вдень і 19-20 ° С вночі, освітленості 5-6 кLx і тривалості фотоперіоду 16 годин.
Ріст стебла і коренів починається на 3-4 день після посадки на живильне середовище, а повністю рослини формуються через 12-15 днів.
Кожне наступне живцювання проводять через 14-20 днів. З однієї рослини можна отримати 5-8 живців, а через 2-3 місяці - 3-5 тис. Живців.
Нижню частину рослини використовують для ІФА. Рослини, заражені вірусами, бракують, а здорові дають початок меріклонам (меристематические клонам).
Для вкорінення рослин, що утворилися при мікрочеренкованіі, їх необхідно пересадити на нову живильне середовище. Живці і пагони легко вкорінюються на середовищах зі збідненим складом мінеральних солей (середа Уайта, Мурасіге-Скуга, розбавлена вдвічі), або на середовищах з додаванням ауксинов: ІУК, НУК, ІМК.
Проростки, що сформувалися в пробірках із середовищами, можна розглядати як невеликі вкорінені рослини, які необхідно адаптувати до звичайних умов вирощування. Такі рослини краще пересаджувати в грунт, коли повністю сформуються 5-6 листків і досить розростуться коріння. Однак, різні види культурних рослин по-різному пристосовуються до зміни умов середовища. Кожна рослина вимагає спеціально підібраних умов культивування в грунті, які встановлюють експериментально.