Іммуноцітохіміі: поліклональні та моноклональні антитіла
Взаємодія антигену зі своїм антитілом - приклад високоспецифічного взаємодії між молекулами. З цієї причини методи з використанням мічених антитіл виявилися найбільш корисними для ідентифікації та локалізації специфічних білків і глікопротеїнів.
В організмі є клітини. які здатні відрізняти свої власні молекули (своє) від чужорідних. У відповідь на вплив чужорідних молекул, відомих як антигени, організм виробляє білки - антитіла, - які специфічно реагують з антигеном і пов'язують його, тим самим сприяючи видаленню чужорідної речовини. Антитіла - білки, що відносяться до сімейства, що включає численні імуноглобуліни.
У іммуноцітохіміческіе дослідженнях зрізи тканини (або клітини в культурі), які можуть містити певні білки, інкубують в розчині, що містить антитіла до цього білка. Антитіла специфічно зв'язуються з білком, локалізацію якого можна простежити за допомогою світлового або електронного мікроскопа, в залежності від типу з'єднання, що використовується для маркування антитіл.
Одне з найбільш важливих вимог до іммуноцітохіміческіе методам - наявність антитіл до виявляти білку. Це означає необхідність попереднього очищення і виділення даного білка з тим, щоб можна було отримати антитіла.
Поліклональні і моноклональні антитіла
Припустимо, що нашим завданням є отримання антитіл до білка х визначенні іншого виду тварини (наприклад, щури) або людини. У тому випадку, коли білок х уже виділено, його вводять тварині іншого виду (наприклад, кролику або козі).
Якщо білок відрізняється настільки, що дана тварина розпізнає його як чужорідний, тобто як антиген, у тварини будуть вироблятися антитіла до цього білка (наприклад, кролячі антитіла до білку х щури або козячі антитіла до білку х людини). Ці антитіла отримують з плазми тваринного і використовують в іммуноцітохіміі.
Кілька груп (клонів) лімфоцитів тварини, якій ввели білок х, можуть розпізнавати різні ділянки молекули білка, причому кожна група виробляє антитіла до відповідної ділянки. Такі поліклональні антитіла є сумішшю антитіл.
Можливо, однак, впливати білком х налімфоціти, що знаходяться в культурі клітин (в дійсності, на лімфоцити, об'єднані з пухлинними клітинами). Окремі клони лімфоцитів вироблятимуть різні антитіла до декількох дільницях молекули білках. Можна виділити кожен клон і культивувати його самостійно - таким чином, щоб різні антитіла до білку х можна було отримувати окремо.
Отримані таким шляхом антитіла - це моноклональні антитіла. Існує ряд переваг використання моноклональних антитіл в порівнянні з поліклональними: наприклад, можна відібрати моноклональні антитіла за високою специфічності і за активністю зв'язування з виявляються білком. Тому буде менше неспецифічного зв'язування з іншими білками, схожими з досліджуваним.
Прямий іммуноцітохіміческіе метод заснований на використанні антитіл (моноклональних або поліклональних), які повинні бути марковані відповідної міткою. Зріз тканини инкубируют з антитілами протягом деякого часу з тим, щоб відбулася взаємодія і зв'язування антитіл з білком х.
Зріз далі промивають для видалення незв'язаних антитіл. Залежно від використаної мітки (флюоресцирующєє з'єднання, фермент, частинки золота) зріз можна досліджувати за допомогою світлового або електронного мікроскопа.
Якщо в якості мітки використана пероксидаза або інший фермент, до вивчення зрізу тканини під мікроскопом слід виявити цей фермент. Ділянки зрізу тканини, що містять белокх, будуть флюоресцировать, виявляться покритими частинками золота або темним осадом, якщо маркером служив фермент.
Непрямий іммуноцітохіміческіе метод має більш високу чутливість, але вимагає більшого числа етапів. Припустимо, що наша мета полягає у виявленні білках, наявного у щурів. Перш, ніж проводити іммуноцітохіміческіе реакцію, слід виконати дві процедури:
(1) спочатку необхідно отримати антитіла (поліклональні або моноклональні) до білка х щури у тварини іншого виду (наприклад, кролика);
(2) паралельно імуноглобулін нормального (не отримуючого ін'єкції) кролика вводять тварині третього виду (наприклад, козі).
Кролячі імуноглобуліни є чужорідними для кози і тому здатні викликати у цієї тварини вироблення антитіл (антитіл до антитіл, або антііммуноглобулінов).
Непряме іммуноцітотохіміческое виявлення спочатку включає інкубацію зрізу тканини щура, що містить білок х, з кролячими антитілами до білка х. Після промивання зрізи тканини инкубируют з міченими козячими антитілами до кролячим антитіл. Ці антитіла до антитіл будуть зв'язуватися з кролячими антитілами, які вже раніше зв'язалися з білком х.
Білок х далі можна виявити з використанням мікроскопічного методу, відповідного мітці, маркованої вторинні антитіла. Існують інші непрямі методи з використанням інших проміжних молекул, такі, як методика з біотином-авидином.