Введення гена в клітину
Типи векторів для введення гена в клітку
Існує кілька типів векторів:
Основна маса клітинної ДНК бактерій міститься в хромосомі (в хромосомі E. coli, наприклад, 4 млн. Пар нуклеотидів). Однак крім хромосом бактерії містять велику кількість дуже маленьких кільцевих молекул ДНК плазмід довжиною кілька тисяч пар основ (молекулярна маса від 1,5 до 300 мегадальтон, 1 МД = 1500 П.О). Такі міні-хромосоми називають плазмидами.
Як правило, плазміди мають в своєму складі гени стійкості до антибіотиків, іонів важких металів (R-плазміди), а також гени, які контролюють катаболізм деяких органічних сполук (плазміди біодеградації, або D-плазміди). Оскільки ці гени знаходяться в плазмидах, вони представлені набагато більшим числом копій. Висока копийность плазмід забезпечує клітці синтез великої кількості ферментів, хімічно нейтралізують антибіотики або ксенобіотики, що і забезпечує стійкість до останніх. Плазміди, мабуть, всюдисущі, так як їх виділяють з різних штамів і видів бактерій, але не є обов'язковими компонентами генома, а в деяких природних штамах плазміди не виявлені взагалі.
Оскільки плазмідна ДНК значно менше хромосомної, її досить легко виділити в чистому вигляді. У присутності іонів кальцію плазміди легко поглинаються бактеріями-реципієнта, навіть якщо ті їх ніколи не містили, і в клітинах бактеріального потомства можна виявити багато копій поглиненої плазміди. Однак бактеріальна клітина зазвичай може містити в своєму складі плазміди одного типу. Це явище несумісності плазмід. Існують групи несумісності - Inc-групи (від англійського incompatibility - несумісність). У такій групі може бути кілька плазмід, сумісних між собою, але не сумісних з іншими плазмідами. У цих плазмід подібні багато ознак і часто значна гомологія ДНК.
Число копій плазміди в клітині може істотно варіювати. Це залежить від генетичних особливостей як клітини, так і плазміди. Плазміди, що знаходяться "під ослабленим контролем", можуть розмножуватися до тих пір, поки їх кількість не досягне 10-200 копій на клітину. Якщо ж плазмида знаходиться "під строгим контролем", вона реплікується з тією ж швидкістю, що і головна хромосома. Такі плазміди містяться в клітці в одній або в декількох копіях. Природно, що для клонування рекомбінантних ДНК намагаються використовувати плазміди першого типу. Але це не обов'язково, так як плазміди в присутності хлорамфеніколу можуть розмножуватись незалежно від поділу хромосоми, і кількість копій плазміди може багаторазово збільшуватися.
Одна їх найбільш часто вживаних плазмід для клонування pBR 322 створена на основі плазмід природного походження, виділених з E. coli. Ця плазміда містить гени стійкості до двох антибіотиків: ампіциліну і тетрацикліну, причому в генах стійкості до цих антибіотиків є сайти рестрикції. Якщо фрагмент чужорідної ДНК вбудовується в один з генів стійкості, то останній інактивується. Отже, успішне вбудовування фрагмента чужорідної ДНК в один з цих генів легко детектувати по зникненню у бактерій стійкості до даного антибіотика. Але при цьому зберігається стійкість до іншого антибіотика. Таким чином вектор дає можливість детектувати тільки ті клони бактерій, які містять рекомбінантний плазмиду.
Є віруси, які не ведуть до загибелі клітини, але вбудовуються в геном клітини-господаря і розмножуються разом з нею, або викликають її неконтрольоване зростання, тобто перетворюють в ракову. До таких відносяться ДНК-віруси SV-40 і вірус поліоми. Впровадження деяких пухлинних РНК-вірусів веде до отпочковиванія вірусних частинок від клітини без її лізису. До таких вірусів належать, наприклад, ретровіруси (вірус саркоми Рауса і СНІДу). Для бактеріальних клітин в якості вектора часто використовують бактеріофаги.
Віруси є одними з головних кандидатів на роль векторів для введення чужорідної ДНК. При вірусної інфекції кожна клітина може отримати велике число копій чужорідного гена. ДНК можна вбудовувати так, щоб вона перебувала під контролем сильних вірусних промоторів, що забезпечить високий рівень експресії гена, і його продукти будуть більш доступні для дослідження.
В останні роки сконструйовані численні "човникові" вектори і їх рекомбінантні похідні, здатні до реплікації в тваринної і бактеріальної клітини й ефективно експресують клонують ген в тваринній клітині. Найбільш поширені вектори складаються з плазміди рВR322 і інтактного раннього району транскрипції ДНК SV40, а потрібний ген вбудовується під контроль промотора пізніх генів або додаткового раннього промотора. Наприклад, в ДНК SV40 був вбудований ген # 946; -глобіна кролика, який експресуватися в лінії клітин мавпи, заражених рекомбінантним вірусом: в клітинах синтезувалися і мРНК гена глобіну, і сам білок.
Вірус повинен бути життєздатним після рекомбинирования його ДНК. Найлегше віруси вводяться в бактерії. Недоліком вірусів як векторів є їх невелика ємність. Крім того, віруси заражають невелике коло господарів.
Існують гібридні вектора, що містять ДНК фага і плазміди. До них відносяться, наприклад, косміди і фазміди.
Косміди - плазмідні вектора, в які вбудований ділянку генома фага # 955 ;, що забезпечує можливість упаковки цієї молекули ДНК в фагів частку. Фагові частки забезпечують гарне проникнення гібридної ДНК в клітину (шляхом ін'єкції), після чого відбувається замикання ДНК в кільце по липким кінців і реплікація її по плазмідними типу.
Фазміди також є гібридами між фагом і плазмидой. Після вмонтування чужорідної ДНК можуть в одних умовах розвиватися як фаги, в інших - як плазміди.
З усіх відомих в даний час інфекційних агентів мають ранг найбільш дивних. Відомо, що найдрібніші віруси, здатні до незалежної реплікації, мають розміри генома, відповідні молекулярної масі 1 М, тобто близько 1500 тис. Пар основ. Це вважали мінімальною кількістю генетичної інформації, необхідної для кодування вірусоспецифічні продуктів і придушення метаболізму хазяйської клітини.
Однак в 1971 році були відкриті інфекційні агенти, являють собою дуже коротку ланцюг 1 Стек гілок ковалентно пов'язаної кільцевої РНК, що складається з 270-300 нуклеотидів (на три порядки менше самих мінімальних вірусів), які не укладену в білкову оболонку. Це незвичайні патогени - найпростіші і найменші з усіх відомих.
Яким чином віроїди продукують симптоми хвороби в інфікованих рослинах, невідомо досі. Встановлено, що вони реплікуються ферментами клітини-хазяїна, не транслюються в видоспецифічі поліпептиди, інтегруються в геном клітини-господаря.
Віроїди заражають персісітентно (не відбувається одужання). Викликають системну інфекцію, тобто мігрують з сайту впровадження в інші частини рослин, переносяться механічно або через клітинний сік, через насіння, пилок. Віроїди також пов'язані з ядерними фракціями рослин і можуть розмножуватися в ядрах.
При роботі з віроїди отримують 1-Стек гілок ДНК копію РНК і добудовують комплементарную нитка для отримання 2-Стек гілок ДНК віроїди. Така 2-цепочечная ДНК вcтраівается в плазміду і передається в клітини E. coli для клонування. Зчитування гена починається з промотора, який впізнається РНК-полімерази, що відповідає за транскрипцію ДНК в матрицю РНК. Зазвичай це фрагмент ДНК з 41-44 пар основ. Ген зчитується зліва направо, від 5 'до 3' кінця гена і закінчується в термінальній області гена. За промотором починається стартовий сайт транскрипції, за яким слід смислова частина гена. Промоторних область гена містить певні короткі поєднання нуклеотидів, характерні для бактеріальних генів, або для генів вищих організмів. Такі поєднання служать сигналами для РНК-полімерази, яка приєднується до промоторной частини гена і починає його зчитувати.
Однонітевиє і двунітевие ДНК здатні ініціювати реплікацію віроїди в механічно інокульованої рослинах тютюну. Ензиматичні in vitro синтезовані також РНК віроідов, високоінфекціонная для рослин. Векторні системи можуть бути розроблені на основі самих РНК, на основі віроідоспеціфічних ДНК, а також в комбінації віроідоспеціфічних ДНК з Ti -плазмідамі. Віроїди інфікують своїх господарів протягом всього їх життєвого циклу, тому в разі використання віроідних векторних систем можна очікувати постійної експресії чужорідного гена в рослині.
Як векторів можуть використовуватися пухлинотворні плазміди бактерій. Види Agrobacterium еволюційно споріднені бульбочкових бактерій, що належать до роду Rhizobium, і мають багато спільних з ними рис. Однак характер взаємодії агробактерій з рослиною має своєрідні особливості.
Взаємодія видів Agrobacterium з рослинами становить особливий інтерес, тому що при цьому виді паразитизму один з партнерів специфічно видозмінює властивості господаря, вставляють свої гени в його геном. Крім того, це є унікальним прикладом міграції ДНК прокаріотів в еукаріотичну клітку. ДНК мітохондрій і хлоропластів Хлоропласти і мітохондрії містять повноцінну генетичну систему, тобто всі компоненти, необхідні для експресії генетичної інформації: ДНК, ДНК-полімерази, РНК-полімерази і белоксинтезирующий апарат (рибосоми, тРНК, аміноацил-тРНК-синтетази).
Хлоропластна і мітохондріальна ДНК також привертають увагу вчених в якості можливих векторів для перенесення генів у клітину. Структурна організація цих клітинних субгеному істотно різниться.
Хлоропласти і інші пластиди мають однакову генетичною інформацією, так званим пластому. У вищих рослин він являє собою замкнуту молекулу ДНК довжиною 150 т. Н. п. достатню для кодування приблизно 100 білків. Для синтезу пластид необхідно значно більше білків. Решта білки кодуються ядром, синтезуються в цитоплазмі і надходять в хлоропласти. Деякі найважливіші білки хлоропластів складаються з декількох субодиниць, частина з них синтезується на рибосомах цитоплазми і транспортується в хлоропласт, де вони об'єднуються з іншими поліпептидами, закодованими в самому хлоропласті і там же синтезуються. Таким чином, для біосинтезу функціонально активного хлоропласта потрібно узгоджена експресія геному і пластому.
Різні типи пластид містять неоднакові кількості ідентичних копій пластому: від 10 - 20 копій в пластидах коренів і зрілих хлоропластах до сотень копій в молодих хлоропластах картоплі. Такий рівень ампліфікації дозволяє сподіватися на надійну експресію чужорідної ДНК при використанні їх в якості векторів в генно-інженерних експериментах. Крім того, гени рибосомальної РНК пластид і великої субодиниці РБФК кодуються геномом хлоропластів. Можливо, введення сильних промоторів в ці гени і додаткова їх модифікація суттєво вплинуть на фотосинтетичну активність рослинної тканини.
Гени рослин також здатні до експресії в клітинах Е. coli. Це гени великий суб'едінци РБФК. Перевага хлоропластних генів полягає в тому, що їх експресія до клітинах кишкової палички може бути досягнута шляхом простого об'єднання транскрібіруемих послідовностей, тому що в ДНК мітохондрій та бактерій до початку стартових кодонів трансляції розташована однакова нуклеотидних послідовність. Це дає можливість синтезувати рослинні економічно важливі поліпептиди за допомогою клітин прокаріотів.
На відміну від хлоропластної, ДНК мітохондрій характеризуються винятковою різноманітністю і їх величина коливається від 200 до 2400 т. Н. п. Однак ніякої кореляції між розміром мітохондріального геному і числом білкових продуктів, синтезованих ізольованими мітохондріями, не спостерігається. Це явище, а також великі розміри мітохондріальної ДНК, мабуть, можна пояснити присутністю ДНК, марною для функціонування мітохондрій.
У складі мітохондріальної ДНК є структурні гени, що кодують поліпептиди, гени рибосомних і транспортних РНК. Однак більша частина білків мітохондрій, як і хлоропластів, кодується ядерними генами. Але якщо геном хлоропластів представлений гомогенної популяцією великих кільцевих молекул, то в мітохондріях міститься кілька класів кільцевих молекул, не всі функції яких ще зрозумілі.
Мітохондріальний геном тварин організмів набагато менше, 15 - 19 т. Н. п. і більш консервативний за структурою. Гени мітохондрій кодують 2 групи ознак - роботу дихальних систем і стійкість до антибіотиків та інших отрут. У мітохондріальному геномі рослин є також гени, що відповідають за ознака чоловічої стерильності цитоплазми.
Транспозони - сегменти ДНК, які контролюють власну транспозицию (переміщення) з одного сайту ДНК в іншій шляхом вирізання з вихідного сайта та впровадження в новий сайт хромосоми або плазміди. Вперше були відкриті в 40-х роках американської наукового Барбарою Мак-Клінток у кукурудзи. Ці гени, індентіфіціровать за їхньою здатністю пригнічувати експресію інших генів кукурудзи, що знаходяться поруч з ними, не мали фіксованого положення в хромосомі. Вони як би пересувалися по всьому геному рослини. Регуляторні елементи могли вбудовуватися і вищепляются, причому після їх вищепленію часто починали функціонувати раніше мовчазні гени.
Виявилося, що гени, асоційовані з регуляторними елементами, ставали нестабільними і часто мутували через нестабільність самих цих елементів. Протягом багатьох років кукурудза залишалася єдиною системою, в якій виявлялися такі рухливі генетичні елементи. Зараз - і у бактерій, дрозофіл і інших організмів.
Механізм переміщення фрагментів ДНК по геному до кінця не з'ясований. ДНК переноситься ферментом транспозази. Фермент кодується послідовність довжиною близько 20 нуклеотидів в середині транспозона. Він специфічно взаємодіє з кінцевими інвертованими повторами мобільного елемента і може вирізати його з хромосоми. Вирізання може відбуватися точно - з відновленням початкової структури ділянки ДНК, і неточно, тобто з делеціями і вставками від одного до декількох нуклеотидів. Це призводить до появи стабільних мутацій і є одним з механізмів створення нових послідовностей ДНК.
Як правило, мобільні генетичні елементи багаторазово повторені в геномі і утворюють гетерогенні сімейства, члени яких дисперговані по хромосомах. Велика частина членів кожного сімейства є дефектними копіями і не кодують будь-якої функції, хоча зберігають здатність до переміщення. Поведінка транспозони можна розцінити як паразитична. Довжина їх від 2 до 10 тисяч нуклеотидних пар. У вищих еукаріот на частку транспозони припадає приблизно 10% ДНК клітини. Більшість їх переміщається зрідка, але, так як їх в клітці досить багато, транспозиція значно впливає на різноманітність видів.
Біологічний сенс переміщення окремих сегментів ДНК:
- переривання відповідного гена, що веде до еволюції;
- регуляція діяльності генів, так як транспозони можуть нести сигнали для початку зчитування генів. У нових областях підсилюють або забороняють роботу гена.
Транспозони також беруть участь в горизонтальному перенесенні генів.
У бактерій були виявлені 2 класу рухомих генів, що розрізняються по довжині і складності організації.
1. Інсерційні послідовності, або 1S елементи, що мають довжину близько тисячі пар нуклеотидів і містять тільки ген, який відповідає за їх переміщення.
2. Транспозони, довжиною від 3 до 20 т. Н. п. складаються з ряду додаткових генів, що відповідають за стійкість бактерій до різних токсичних речовин.
Оскільки рухливі гени можуть переміщатися в межах геному з одного місця на інше, то вони можуть бути дуже ефективними векторами для передачі рекомбінантної ДНК. Генетична трансформація за допомогою векторів на основі транспозони була вперше здійснена на дрозофілі. За допомогою транспозіруемого елемента Р дрозофілі був переданий ген, який зумовлює коричневе забарвлення очей. Перенесення генів за допомогою транспозони має великі переваги, так як він відбувається з високою частотою і не тягне значних перебудов интегрируемой ДНК. Крім того, цим методом можна переносити досить великі фрагменти ДНК.
Інші розділи: