Етапи ЕКО в малюнках
На фото- катетер для переносу ембріонів.
Обрані для перенесення ембріони поміщаються під електронним мікроскопом в катетер і переносяться в середню частину порожнини матки.
Схема проведення пункції фолікулів
Пробірки з рідиною надходять до ембріологові, який під електронним мікроскопом здійснює пошук яйцеклеток.Пункція фолікулів.
На даному етапі ембріолог оглядає фолікулярну рідину (вміст фолікулів) на наявність яйцеклітин (Рис. 4), які представляють собою комплекс, що складається з клітин кумулюса (а), клітин «променистої корони» (b) і безпосередньо яйцеклітини (с). При цьому два шари (a і b) виконують живильну і захисну функції для яйцеклітини. Отримані при пункції яйцеклітини ембріолог поміщає в «середу запліднення», попередньо підготовлену для культивування в спеціальному посуді (чашка Петрі або планшет) і вміщену в інкубатор. Посуд для культивування маркується індивідуальними даними подружньої пари і кількістю отриманих яйцеклітин.
Тривалість пункції 15-20 хвилин.
Запліднення і культивування ембріонів.
Обробка сперми перед ЕКО
Зрілий сперматозоїд з уплощенной грушоподібної головкою довжиною близько 6 мкм і шириною в екваторіальному сегменті близько 4 мкм. состяощую з ядра і акросоми, що містить літичні ферменти і розташована у вигляді шапочки над верхньою половиною головки. Хвот має довжину близько 50 мкм і починається від головки в районі шийки, де розташований центриоль і комплекс мітохондрій.
Перш ніж потрапити в ооцит, сперматозоїд долає кілька перешкод:
-cumulus, у міру просування всередину cumulus поведінку сперматазоідов різко змінюється: різко зростає швидкість, настає фаза гіперактивності;
-досягає zona pellucida, де відбувається його зв'язування з рецептором.
Потім відбувається акросомная реакція - мембрана акросоми і цитоплазматическая мембрана ооцита зливаються, вміст акросоми викидається в місці
зв'язування з zona pellucida і спематозоїда просувається крізь оболонку ооцита, все ще перебуваючи в фазі гіперактивності.
Потрапляючи в простір між zona pellucida і мембраною ооцита сперматозоїд прикріплюється до рецепторів на мембрані ооцита рецепторами на екваторіальній частині головки під акросомой, що викликає кортикальну реакцію, що призводить до незворотних процесів zona pellucida, що робить її непрохідною для інших сперматозоїдів. Через кілька годин генетичний матеріал обох гамет зливається. виникає зигота, і хромосоми готуються до першого поділу дроблення.
На наступний день ооцити переносять в лунку зі свіжою середовищем і під мікроскопом дивляться на предмет запліднення.
Пронуклеуси з'являються через 10-16 годин після додавання сперматозоїдів іісчезают через 6-8 годин після появи. Якщо їх не вдається виявити -оплодотвореніе не відбулися. Якщо видно один пронуклеус або більше двох-сталося аномальне запліднення.
Запліднення проводиться ембріологом у встановлений час шляхом додавання з пробірки за допомогою спеціального дозатора зі стерильним наконечником суспензії рухливих сперматозоїдів в «середу запліднення» з яйцеклітинами. При цьому в залежності від показників спермограми кількість сперматозоїдів може варіювати від 25 тисяч до 100 тисяч на одну яйцеклітину. Потім яйцеклітини (в промаркірованій посуді) поміщаються в інкубатор до моменту оцінки ознак запліднення.
Наявність ознак запліднення ембріолог здійснює під мікроскопом через 16-20 годин після проведення процедури запліднення (1 день культивування). При цьому заповнюється спеціальний протокол, в якому зазначаються особливості запліднення кожної яйцеклітини індивідуально. Для детального огляду яйцеклітин їх спеціальними мікроінструменту очищають від клітин корони і кумулюса і переносять в чашки з індивідуальними краплями «середовища дроблення». Ознаками нормального запліднення є наявність в цитоплазмі заплідненої яйцеклітини двох утворень круглої форми, званих пронуклеуса (Рис.1).
Слід знати, що при пункції не всі отримані яйцеклітини можуть бути зрілими, і, отже, можуть не запліднитися. Крім зрілих яйцеклітин існує ще дві стадії їх розвитку - незрілі і недозрілі. Незріла яйцеклітина має в цитоплазмі «зародковий пухирець» (Рис.2а), в процесі дозрівання він розсмоктується і в недозрілий яйцеклітині непомітний (Рис. 1b). Про зрілість яйцеклітини говорить поява освіти, званого «першим полярним тілом» (Рис 2 c)
При цьому, якщо при пункції отримані зрілі яйцеклітини, це не означає, що всі вони повинні нормально запліднитися. Поряд з нормальним заплідненням, в яйцеклітинах може бути виявлено відсутність запліднення або ознаки того, що яйцеклітина запліднена ненормально, тобто аномально. В останньому випадку при огляді ембріолог бачить в цитоплазмі один, три або більше пронуклеусов (Ріс.3a, b). Запліднені подібним чином яйцеклітини вилучаються з процесу культивування в циклі ЕКЗ з метою запобігання перенесення в порожнину матки ембріонів, отриманих з них. Дані ембріони можуть бути використані тільки в дослідницьких цілях, наприклад, для поліпшення методик культивування, а також освоєння нових або вдосконалення існуючих мікроманіпуляціонной технік. Основними причинами аномального запліднення є якість яйцеклітин.
Культивування ооцитів і ембріонів людини виробляється в присутності 5% СО2 в повітрі при температурі 37 градусів і вологості 80-90%. Ці умови дотримуються при використанні СО2 інкубаторів, які підтримують необхідну температуру, вологість і рівень СО2 в камері, який підтримується в камері за допомогою подачі вуглекислого газу з балона, де він знаходиться в зрідженому стані, і з повітря з навколишнього середовища. Вологість підтримується постійним випаровуванням води з дна камери або зі спеціального лотка. У деяких сучасних камерах є система інжекції води в циркулює повітря, автоматично підтримує вологість в камері до 90%.
5. Оцінка дроблення (розвитку ембріонів)
Через 48 годин після проведення пункції ембріолог оцінює нормально запліднені яйцеклітини за характером подальшого розвитку. Дані про особливості розвитку (ділення) ембріонів заносяться в спеціальний ембріологічний протокол. Найбільш поширена класифікація якості ембріонів за кількістю бластомерів і наявності фрагментів (неправильно діляться бластомерів), представлена на Рис. 4. Бластомери ембріонів відзначені «b», фрагменти «f». Кращий за якістю ембріон відзначений «1», ембріон посередньої якості «4». Слід розуміти, що зовнішня оцінка не може говорити про потенціал розвитку ембріона на 100%, тому навіть якщо ембріони мають задовільну якість, слід робити процедуру перенесення ембріонів, оскільки зберігаються шанси на настання вагітності і наступні пологи, хоча ці шанси нижче, ніж у ембріонів відмінного якості.
Перенесення ембріонів в порожнину матки.