Визначення рухливості сперматозоїдів.
Кінезисграма - це процентне співвідношення в еякуляті сперматозоїдів з різною рухливістю. Кількість рухливих сперматозоїдів є головним критерієм при оцінці їх повноцінності. За допомогою віконця фоніо підраховують в нативному препараті 100 сперматозоїдів, відзначаючи кількість з нормальною рухливістю (нормокіноспермія), з ослабленою (гіпокіноспермія) і нерухомих (акіноспермія).
Кількість сперматозоїдів з нормальною рухливістю (поступальною ходою зі швидкістю 50 мкм / с) в нормі становить 80-90%, з ослабленою (повільними поступальними рухами) - 10-12%, нерухомих - 6-10%.
Наявність у сперматозоїдів коливальних рухів - діскіноспермія в нормі не спостерігається.
Для отримання динамічної кінезисграма протягом 24 год визначають відсоток рухливих сперматозоїдів через певні проміжки часу. Нормальна кількість сперматозоїдів і нормальна кінезисграма при низьких показниках динамічної кінезисграма свідчать про слабку запліднюючої здатності (астеноспермія).
Краплю сперми наносять на покривне скло, перевертають його і кладуть на предметне скло з луночку для висячої краплі таким чином, щоб крапля опинилася в центрі поглиблення. Краї покривного скла змащують вазеліном і під мікроскопом визначають відсоток нормо, гіпо-, і акіносперміі через 3, 6, 12 і 24 годин після еякуляції. Дослідження проводять при кімнатній температурі. У нормі через кожні 3 год нормокіноспермія зменшується на 20%.
Проба на «пожвавлення» сперматозоїдів.
При акіносперміі в свіжому еякуляті понад 30% можливе порушення запліднюючої здатності, але тільки за умови неможливості «оживити» сперматозоїди. Безуспішність спроби «пожвавлення» свідчить про некроспермії нерухомих сперматозоїдів. Як стимулюючих ( «оживляючих») розчинів можна використовувати наступні:
1) розчин Бекера: глюкоза - 3 г, Na2 HP04 - 0,6 г, NaCl - 0,2 г, КН2 Р04 - 0,01 г, дистильована вода - до 100 мл (pH 7,8);
2) 0,1% розчин кофеїну (не можна користуватися кофеїном в ампулах);
3) 0,1 М розчин аргініну і ін.
Пробу на «пожвавлення» необхідно проводити паралельно з будь-якими двома із зазначених стимулюючими розчинами.
Мірної піпеткою місткістю 1 мл насмоктують 0,1 мл сперми (добре перемішаної), після чого цій же піпеткою набирають 0,9 мл будь-якого стимулюючого розчину. Видувають вміст піпетки на годинне скло, ретельно перемішують, готують препарати висячої краплі для визначення динамічної кінезисграма і досліджують їх під мікроскопом. Через 5 10 хв нерухомі, але живі сперматозоїди починають рухатися. Відсоток рухливих сперматозоїдів визначають протягом 24 год через кожні 2-3 год.
Підрахунок сперматозоїдів в 1 мл і у всемоб'еме еякуляту.
Кількість сперматозоїдів в еякуляті підраховують в лічильної камері Горяєва. Ретельно перемішану сперму набирають в меланжер для лейкоцитів до позначки 0,5 (розведення в 20 разів), потім до мітки 11 набирають рідину для розведення і заповнюють камеру Горяєва.
Для розведення сперми використовується будь-яка з наступних рідин: розчин бікарбонату натрію: гідрокарбонат натрію - 5 мл, концентрований формалін - 1 мл, дистильована вода - 100 мл (можна готувати без двовуглекислого натру, який додається для розчинення слизу); 2) рідина Рубенкова: основний фуксін- 0,1 г, барвник Романовського - 0,02 мл, концентрована карболова кислота 0,2 мл, гліцерин -0,1 мл, етиловий спирт ректифікат - 2 мл, 1% натрію хлорид- 100 мл. Переваги рідини Рубенкова полягають в тому, що вона забарвлює сперматозоїди. Це, поряд з підрахунком загальної кількості сперматозоїдів, дозволяє визначати сперматограмма. Використовуючи окуляр 7Х і об'єктив 40X, підраховують всі сперматозоїди в п'яти великих квадратах, розташованих по діагоналі (вважають тільки ті сперматозоїди, головки, яких лежать всередині квадрата) і множать на 1 000 000. Отримане число відповідає кількості сперматозоїдів в 1 мл досліджуваної сперми. Для підрахунку сперматозоїдів в лічильної камері Горяєва можна використовувати і пробірочний метод.
Кількість сперматозоїдів у всьому еякуляті визначають шляхом множення числа сперматозоїдів в 1 мл на обсяг еякуляту (в мл). У нормі кількість сперматозоїдів в еякуляті перевищує 150 млн.
Методом підрахунку в камері Горяєва можна визначити число рухливих сперматозоїдів. Для цього сперму розводять теплим фізіологічним розчином натрію хлориду і підраховують в камері тільки нерухомі сперматозоїди, а потім із загальної кількості сперматозоїдів віднімають кількість нерухомих.
У нормі в 1 мл сперми міститься 60 120 млн. Сперматозоїдів, при гіперсперміі - понад 120 млн. При олігоспермії - від 30 до 60 млн.
Для визначення справжнього числа сперматозоїдів при олігоспермії необхідні
2-3 контрольних підрахунку з інтервалом
3-4 тижні. У одного і того ж чоловіка число сперматозоїдів схильне великим фізіологічних коливань.
Сперматограмма - це сукупність результатів кількісного дослідження сперми. Для визначення сперматограмми препарати забарвлюють по Паппенгейма або гематоксилін-еозином і підраховують з иммерсионной системою мікроскопа не менше 200 сперматозоїдів. При цьому можна використовувати машинку для підрахунку лейкограми. У нормальній спермі сперматозоїди нормальної форми складають 80-85%, в їх число входять фізіологічні варіанти, які характеризуються або незвично звуженої, або зменшеною, або збільшеною головкою. Молоді, або незрілі, форми сперматозоїдів мають навколо головки і шийки залишок цитоплазми (комірець »), спостерігаються при частих статевих зносинах і не здатні до запліднення. Старі форми сперматозоїдів характеризуються гіперхромією, ахроміі або вакуолізацією головки, з'являються в спермі після тривалого утримання від сексу і непридатні для запліднення.
До дегенеративним (патологічним) формам відносять сперматозоїди з деформаціями головки: мегалосперматозоіди (гігантосперматозоіди), сперматозоїди з двома головками, але з однією шийкою і одним хвостом, а також без шийки з одним або декількома хвостами, без хвоста, з хвостом без головки і ін.
У здорових чоловіків з нормальною спермою патологічних форм сперматозоїдів зазвичай не зустрічаються, але іноді їх кількість при нормальній плодючості може досягати 20%, з них приблизно 15% становить патологія головки, 3-5% - тіла і 2-5% - хвоста.
При патологічному сперматогенезе і секреторному безплідді виявляються сперматозоїди переважно з патологією головки і шийки. Патологія хвоста зазвичай екськреторного походження, виникає при проходженні сперматозоїдів по патологічно зміненим сім'явиносних шляхах. У нормальній сперматограмма клітини сперматогенезу складають 0,5-2%.
Для фазовоконтрастнок мікроскопії сперму розводять фізіологічним розчином хлориду натрію з додаванням невеликої кількості 1% водного розчину риванолу або карболової кислоти для зменшення рухливості сперматозоїдів.
При люмінесцентної мікроскопії з використанням в якості флюорохромами акридинового оранжевого в розведенні 1. 20 000 в нативної сперми легко диференціюються живі, пофарбовані в зелений колір, і загиблі, пофарбовані в оранжевий колір, сперматозоїди. Розрізнити нормальні і патологічні форми сперматозоїдів внаслідок їх морфологічних особливостей легко.
Правила роботи на фазовоконтрастной і люмінесцентному мікроскопах описані в інструкціях до цих приладів. Морфологічні форми сперматозоїдів при фазовоконтрастной і люмінесцентної мікроскопії враховують таким же чином, як і при звичайній світловій мікроскопії.
Керівництво до практичних занять з клінічної лабораторної діагностики / Под ред. проф. М.А. Базарнова, проф. В.Т. Морозовой.- К. Вища школа, 1988.- 318 с. 212 мул.