Найкращими середовищами для багатьох цілей є розбавлені або не розбавленого плазма або сироватка.
Інші середовища містять сироватковий або будь-якої іншої альбумін або ж інші білки, включаючи желатин, розчинені в сольових розчинах. У зв'язку з цим виникла необхідність вивчення різних сторін впливу білків на процес заморожування в розбавлених водних середовищах. Так, Лузена показав, що присутність в низькій концентрації альбуміну сильно затримує ріст кристалів льоду у воді і в розчинах неорганічних солей. Підвищення концентрації понад 10% давало слабкий ефект.
Винятковий інтерес представляють дослідження Люйета, який за допомогою спеціального заморожує мікроскопа спостерігав утворення кристалів льоду в тонких плівках розчинів з високою концентрацією бичачого альбуміну і в гелях, що містять 30-50% желатини, при різних швидкостях заморожування. При цьому йому вдалося сфотографувати призми, зірки, розетки і шестикутні кристали різноманітної форми, що утворилися в тонких плівках 35-відсотків розчину бичачого альбуміну, заморожених при -3 °. Коли препарати заморожували при більш низьких температурах і, отже, з більшою швидкістю, гексагональная симетрія візерунка кристалів кілька порушувалася і утворювалися неправильні розетки.
Люйет встановив, що при надшвидкому охолодженні тонких плівок гелів, що містять 30-50% желатини, або розчинів з високою концентрацією інших білків кристалізація проходила у вигляді появи найтоншої легкої димки, яка покривала весь препарат. Ця серпанок поступово бліднула, і незабаром вся плівка при розгляді її під звичайним мікроскопом виявлялася прозорою. Люйет назвав кристали такого типу «бистроісчезающій кулястими дисками». Не ясно, чи відбувалася тут справжня кристалізація або ж плівки вітріфіцірованних. В даний час Люйету вдалося довести, що плівка желатин після надшвидкого охолодження має кристалічну структуру, зберігаючи зовні вигляд прозорого аморфного речовини. Люйет зареєстрував за короткочасний період охолодження тимчасове підвищення температури в препараті. Це підвищення температури збігалося з моментом появи і поширення найтоншої димки, про яку говорилося вище. При зігріванні в результаті перекристалізації прозора плівка ставала каламутною. Мерімен для вивчення прозорих плівок, що утворюються при надшвидкому охолодженні гелів желатину, використовував дифракцию рентгенівських променів. Рентгенограми показали присутність кристалів, що відбивали рентгенівські промені під одним кутом. Після перекристалізації, що наступала під час зігрівання, рентгенівські промені відбивалися під трьома кутами.
На підставі описаних спостережень був зроблений один важливий висновок. Склоподібна речовина, що утворюється в результаті надшвидкого охолодження до дуже низьких температур, містить дрібні кристалики льоду. Це не справжнє склоподібне речовина, що є аморфним, з безладним розташуванням молекул. Мікроскопічні препарати живих клітин і тканин, які пережили надшвидке охолодження до дуже низьких температур, які раніше вважали вітріфіцірованних, ймовірно, містили такі кристали. Люйет підкреслює, що треба дуже обережно вживати такі терміни, як «склоподібний», «остекленение» ( «вітрифікація»), «скляний», «расстеклененіе» ( «девітріфікація»). Назріла необхідність у новій термінології, проте введення цих нових термінів в даний час може погіршити плутанину.
Люйет розрізняє чотири фактори, які теоретично можуть перешкоджати процесу кристалізації при швидкому охолодженні: 1) зменшення числа центрів кристалізації; 2) уповільнення росту кристалів із центрів; 3) зменшення всього загальної кількості утворився льоду; 4) погіршення ступеня «упорядкованості» молекул. Він показав експериментально, що підвищення швидкості охолодження розбавлених водних розчинів не перешкоджав утворенню центрів кристалізації. Навпаки, число їх збільшувалося при прискоренні охолодження з 300 до 1200 ° в 1 сек. Не було також ніяких ознак уповільнення росту кристалів при підвищених швидкостях заморожування 40-відсоткових гелів желатину. Співвідношення між швидкістю охолодження і кількістю що утворився льоду не було визначено. Рентгенографічні дослідження показали, що кристалізація починалася при охолодженні 30-процентного розчину желатини зі швидкістю декількох тисяч градусів в 1 сек. Таким чином, можна говорити про хоча б часткове «впорядкування» молекул.
Деякі ферменти і багато інших білки, розчинені в фізіологічних сольових середовищах, переносять тривале зберігання в замороженому стані і подальше зігрівання, що не дегенеріруя і не втрачаючи характерних властивостей. Леціто-вителлин ж, основний ліпопротеїд яєчного жовтка, навпаки, швидко дегенерує при заморожуванні і відтаванні. На це вказує втрата плинності яєчним жовтком, замороженим при температурі нижче -6 °. Леціто-вителлин осідає також і при заморожуванні фізіологічної сольовий середовища, в якій його розвели. З комплексу ліпопротеїдних молекул випадає липид. При швидкому заморожуванні розчину при дуже низькій температурі з наступним швидким согреванием пошкодження наступають не так скоро. Характерно, що втрата розчинності леціто-вітеллін в розчинах хлористого натрію і випадання ліпідів наступають при -3 ° раніше, ніж при -20 °, При температурі -20 ° концентрація солей в частково замороженої середовищі дуже висока (близько 30 г на 100 г води ). Таким чином, пошкодження, наступаючі під час заморожування, не можна приписати дії концентрації солі. У той же час леціто-вителлин пошкоджується, якщо pH суспензійний середовища падає нижче 5,2, а це може відбуватися при заморожуванні забуферений фізіологічних сольових середовищ. Реакція ліповітелліна на заморожування обговорюється в роботі Лавлока.
Іншим білком, який, як відомо, пошкоджується при заморожуванні, є бета-ліпопротеїди людської плазми. Денатурація його виражається насамперед у тому, що він перестає розчинятися в фізіологічному розчині. Лавлок заморожував на різний час і при різних температурах розчини бета-ліпопротеїду в 0,16 М хлористом натрію. Потім він їх відтавав і реєстрував найменшу тривалість заморожування, необхідну для появи перших ознак помутніння. Результати дослідів показали, що при -18 ° ознаки денатурації з'явилися тільки через 10 днів, при -20 ° - через 1 добу, а при -33 ° - вже через кілька хвилин. Зміни в білку явно відбувалися швидше при температурах нижче евтектичною точки хлористого натрію. p-ліпопротеїдів в насиченому розчині хлористого натрію при 0 ° майже не втрачав своєї розчинності. Вплив зміни величини pH відчували шляхом порівняння ушкоджень, що сталися в тих випадках, коли забуферений при різних pH розчини бета-ліпопротеїду заморожували при -40 °. Отримані результати показували, що мали місце більш виражені відхилення pH розчину від норми, але вони все ж таки не були єдиною причиною денатурації. Потім ліпопротеїд розчиняли в розчинах інших солей з евтектичними точками від -4 до -86 °. Розчини охолоджували, витримували 15 год при -40 ° і відтавали. Найбільш важкі ушкодження були в розчинах з найвищою евтектичною точкою, а найбільш легкі - в тих випадках, коли евтектична точка лежала нижче -40 °. Отже, денатурація, мабуть, залежить від вимерзання води з розчину і буває особливо вираженою, коли вимерзають останні залишки води. Це може привести до фізичного зіткненню окремих молекул ліпопротеїду і навіть до вимерзання деяких зазвичай асоціюються з ним молекул води. Висушування як при нормальній температурі, так і після часткового заморожування теж тягне за собою денатурацію р-ліпопротеїду плазми. Це підтверджує припущення, що причиною пошкодження під час заморожування служить зникнення навіть слідів води, що перетворилася в лід.
Поділіться посиланням з друзями