Основним методом діагностики криптоспоридіозу є мікроскопічне виявлення збудника. Для цього застосовують прижиттєві та посмертні методи діагностики.
Прижиттєва діагностика криптоспоридіозу молодняка сільськогосподарських тварин заснована на виявленні цих паразитів в фекальних масах.
Приготування препаратів з фекалій. На знежирене предметне скло наносять кілька крапель рідких фекалій хворих тварин (краще з грудочками слизу) і роблять тонкий мазок. Препарат добре висушують, після чого фіксують спирт-ефіром або метанолом протягом 10 хв, висушують і кілька разів проводять над полум'ям спиртівки.
Для збільшення кількості криптоспоридий в досліджуваному матеріалі можна застосовувати різні методи збагачення. Одним з них є комбінований метод центрифугування з використанням флотаційних розчинів. В якості останніх можна застосовувати розчини нітрату амонію з щільністю 1,3 (1500 г речовини на 1 л води), сірчано-кислого цинку з щільністю 1,24 (400 г солі на 1 л води), нітрату натрію з щільністю 1,38- 1,40 (1000 г речовини на 1 л води), сульфату магнію з щільністю 1,26 (920 г солі на 1 л води) і ін.
Пробу фекалій масою 3 г поміщають в стаканчик і, постійно помішуючи, доливають 50 мл води. Суспензія фільтрують в центрифужную пробірку і центрифугують протягом 1,5-2 хв зі швидкістю 3000 об / хв. Після цього надосадову рідину зливають, в пробірку наливають один з флотаційних розчинів, скляною паличкою розмішують осад і повторно центрифугують. Потім дротяною петлею знімають верхній шар рідини з центрифужной пробірки, переносять краплі на добре знежирене скло, попередньо покрите плазмою або альбуміном, і роблять мазок. Мазки добре висушують, фіксують і забарвлюють.
Забарвлення препаратів за Ціль-Нільсеном. Спочатку готують карболовий фуксин. Для цього беруть основного фуксину 2 г, етилового спирту (96 °) 12 мл, карболової кислоти 5 г і дистильованої води до 100 мл.
Приготовану фарбу наносять на препарат і витримують без підігрівання 25-30 хв. Після цього мазок промивають водою, наносять на препарат 8-10% -ний розчин сірчаної кислоти і витримують 40-60 с.
Повторно промивають препарат водою і протягом 3 5 хв забарвлюють його 5% -ним розчином малахітового зеленого в 10% -ному етанолі. Препарат промивають водопровідною водою, висушують і проводять мікроскопію з використанням імерсійної системи.
В результаті фарбування ооцисти криптоспоридий діаметром 4-5 мкм мають яскраво-червоний колір, а мікрофлора мазка забарвлюється в зелений. Приготовлені і пофарбовані за цим способом препарати добре зберігаються.
Забарвлення препаратів за Романовським-Гімза. На фіксований препарат наносять 10% -ний розчин фарби Романовського-Гімза. Через 30 хв її змивають водою, препарат висушують і проводять мікроскопію. При цьому ооцисти криптоспоридий фарбуються слабо. Усередині їх іноді можна виявити подовжені і вигнуті спорозоїти, які розташовані на периферії ооцист.
Забарвлення препаратів за Кестеру. Готують розчин сафраніну. Для цього до 2 частинах насиченого водного розчину сафраніну додають 5 частин 5,6% -ного розчину калійної луги.
На фіксований мазок наносять приготовлену фарбу сафраніну. Через 5 хв препарат промивають водою і покривають на 10 з 0,1% -ним розчином сірчаної кислоти. Препарат повторно промивають водою і дофарбовують протягом 12 з 5% -ним розчином малахітового зеленого, промивають водою, висушують і досліджують за допомогою мікроскопа з иммерсионной системою.
Метод Вільсона. У центрифужную пробірку набирають 1 мл фекалій, додають 2 мл 2,5% -ного розчину біхромату калію і 5 мл розчину сахарози (1,26 г на 1 мл) в дистильованої воді. Вміст пробірки перемішують скляною паличкою і центрифугують протягом 10 хв зі швидкістю 800 об / хв. З верхнього меніска вмісту пробірки петлею знімають кілька крапель розчину і переносять їх на предметне скло, покривають їх склом і проводять мікроскопію при збільшенні X 400. У поле зору мікроскопа-ооцисти кріп-тоспорідій світлі на темному фоні інших структур.
Виявлення криптоспоридий за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Мазки фекалій обробляють розчином аурамін з карболової кислотою. Після цього їх промивають водою і забарвлюють протягом 8-10 хв розчином карболового фуксину. Повторно препарат промивають водою, висушують і досліджують за допомогою флуоресцентного мікроскопа з иммерсионной системою. При цьому виявляють ооцисти криптоспоридий у вигляді яскраво флуоресціюючих дисків на темно-червоному тлі.
Для посмертної діагностики криптоспоридіозу беруть вміст худої або клубової кишки або роблять зіскрібки зі слизових оболонок їх. Матеріал наносять на знежирене скло, роблять мазок, висушують його, фіксують і фарбують по описаним вище методам. Можна також взяти 1 г вмісту клубової або тонкої кишки і досліджувати його за описаним вище методом Вільсона.
Токсоплазмоз діагностують за допомогою різних методів досліджень, що включають епізоотологичеськие, клінічні і лабораторні. Епізоотологічних дослідженнями виявляють тварин з неясною етіологією захворювання: поява мертвонароджених плодів, абортів, всіляких каліцтв і т. Д. Токсоплазмоз клінічно може проявлятися у вигляді паралічів, парезів, кон'юнктивітів, пневмоній, лихоманки, розлади роботи серцево-судинної системи і органів шлунково-кишкового тракту .
Лабораторні дослідження включають в себе мікроскопію мазків або гістологічних зрізів різних органів і тканин: головного мозку, печінки, нирок, селезінки, легенів, лімфатичних вузлів, серця. Токсоплазмоз можна виявити також в лікворі, плодових водах, сечі, фекаліях.
Для діагностики токсоплазмозу ставлять також биопробу на лабораторних тварин, проводять іммуносерологіческпе і копроскопіческіе дослідження фекалій кішок з метою виявлення ооцист.
Із зазначених вище органів не пізніше ніж через 2-3 години після загибелі тварин готують мазки-відбитки, фіксують їх метиловим спиртом (можна етиловим спиртом або сумішшю Нікіфорова) протягом 8-10 хв, забарвлюють за Романовським-Гімза протягом 45 хв. Препарат промивають водою, висушують і проводять мікроскопію з иммерсионной системою.
Найбільш типовою формою позаклітинних токсоплазм є дугоподібна або напівмісячна форма паразита, у якого один кінець подовжений і гострий, другий - широкий і округлий. Тканинні токсоплазми зазвичай округлої або овальної форми, рідше вони мають форму півмісяця. Розміри їх досягають 4-7х2-4 мкм.
Виявлення ооцист токсоплазм в фекаліях кішок проводиться копроскопіческім методом із застосуванням центрифугування і флотаційних розчинів. Для цього беруть 1 г фекалій, поміщають в фарфорову ступку, додають 8-10 мл води, 3 краплі 1% -ного розчину карболової кислоти і добре розтирають товкачем. Суміш з ступки фільтрують через металеве або капроновое ситечко в центрифужную пробірку і центрифугують при швидкості 2500 об / хв протягом 10 хв. Після цього надосадову рідину зливають, до осаду доливають розчин аміачної селітри з щільністю 1,3 (або іншого флотаційного розчину з густиною більше 1,15), скляною паличкою розмішують осад з розчином солі і повторно центрифугують зі швидкістю 1500 об / хв протягом 5 хв .
Потім з поверхневого шару рідини центрифужной пробірки металевою петлею знімають 5-6 крапель, наносять їх на знежирене предметне скло і проводять мікроскопію.
Біопроба також є одним з основних методів діагностики токсоплазмозу. Для її проведення беруть наважку в 1 г шматочків головного мозку, печінки, селезінки, лімфатичних вузлів або органів абортовану плода, поміщають в стерильну порцелянову ступку, додають туди 3 мл фізіологічного розчину і ретельно розтирають. Отриману суспензію вводять внут-рібрюшінно по 0,5 мл 4-5 білим мишам. При наявності токсоплазм в вихідному матеріалі у них через 5-7 днів після введення суспензії з'являється важка форма хвороби. При цьому в черевній порожнині мишей утворюється до 3 мл транссудату, що містить велику кількість ендозоіти. Для виявлення токсоплазм беруть транссудат з черевної порожнини, готують мазки, з головного мозку роблять мазки-відбитки. Приготовлені препарати фіксують і забарвлюють за Романовським-Гімза, потім просушують і проводять мікроскопію на наявність ендозоіти з використанням імерсійної системи, на наявність цист препарати переглядають при збільшенні мікроскопа 7х20.
Іммуносерологіческую діагностику токсоплазмозу проводять із застосуванням токсоплазменного антигену.
Вона проводиться на підставі епізоотологічних, клінічних, серологічних і мікроскопічних досліджень, за даними патоморфологічних розтинів.
Компресорний метод виявлення саркоцист. Для цієї мети беруть проби м'язів різних органів - стравоходу, діафрагми, серця, скелетних м'язів і з кожної проби по ходу м'язових волокон вирізають по 4 зрізу завбільшки з вівсяне зерно (І. І. Вершинін, 1982). Зрізи поміщають на скло компрессоріума, накривають другим склом і здавлюють за допомогою гвинтів. Після цього проводять мікроскопію при збільшенні 7х8.
Препарати можна підфарбовувати за допомогою розчину фарби Романовського-Гімза (2 краплі фарби на 1 мл дистильованої води) протягом 1 год. Після цього препарати обесцвечивают нашатирним спиртом.
Фарбувати препарати можна і за іншою методикою. Для цього спочатку готують фарбу: до 30 мл 10% -ного розчину метиленової сині додають 30 мл 0,01% -ного розчину калійної луги і отриману суміш розбавляють порівну дистильованою водою. Отриманою фарбою можна фарбувати препарати протягом 10 хв з подальшим знебарвленням 25% -ним розчином аміаку (Г. В. Кононенко, 1968).
Для виявлення мерозоитов найбільш зручним є метод М. Коzаr (1971). Беруть 2-5 г м'язової тканини, поміщають в фарфорову ступку, додають 1 2 мл фізіологічного розчину і ретельно розтирають. Потім беруть краплю отриманої суспензії, поміщають її на знежирене предметне скло, покривають покривним і проводять мікроскопію при затемненому полі. Мерозоі-ти видно у вигляді банановідних утворень.
Для прижиттєвої діагностики саркоцістоза м'ясоїдних застосовують методи центрифугування з використанням флотаційних розчинів.
Таблиця 8. Відмінні риси саркоспорідій,