Керівництво до практичних занять з мікробіології
Метод, заснований на отриманні зростання мікроорганізму безпосередньо на предметному склі, дозволяє вести мікроскопічне спостереження за процесами росту і розвитку, впливом токсичних та інших агентів на ці процеси. На препаратах не порушується природне розташування клітин в зростаючої колоПрепарат «висяча крапля». Краплю суспензії мікроорганізмів петлею або звичайним пером наносять на покривне скло, яке повертають краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) в центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Краї лунки попередньо змащують вазеліном. Крапля виявляється герметизированной у вологій камері, що робить можливим багатоденне спостереження за об'єктом. Для тривалих спостережень використовують стерильні скла, а суспензію мікроорганізмів готують в рідкому поживному середовищі.
ванні. Зростання можна здійснювати в аеробних або анаеробних (під покривним склом) умовах.
Агарове плівку можна нанести на покривне скло і приготувати препарат «висяча крапля». На такому препараті можна спостерігати рух бактерій за типом ковзання.
6.2.2. Препарати фіксованих забарвлених клітин мікроорганізмів
Приготування фіксованих забарвлених препаратів включає наступні етапи: приготування мазка, висушування, фіксацію і забарвлення.
Приготування мазка. На знежирене спиртом предметне скло поміщають маленьку краплю водопровідної води і переносять у неї петлею невелику кількість досліджуваного матеріалу, як для препарату «роздавлена крапля». Отриману суспензію рівномірно розмазують петлею на площі 1-2 см2 можливо більш тонким шаром. Мазок повинен бути настільки тонкий, щоб висихав після приготування.
Висушування мазка. Найкраще сушити готовий препарат при кімнатній температурі на повітрі. Добре приготований тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнено, то препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря високо над полум'ям пальника, тримаючи скло мазком догори. Цю • операцію слід проводити обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.
Фіксація препарату переслідує кілька цілей: вбити мікро-організми, т. Е. Зробити безпечним подальше поводження з ні-ь? І; забезпечити краще прилипання клітин до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до фарбування, так як мертві клітини фарбуються краще, ніж живі. Найпоширенішим способом фіксації є термічна обробка. Для цього препарат зазвичай тричі проводять через найбільш гарячу частину полум'я пальника, тримаючи предметне скло мазком догори. Не слід перегрівати мазок, так як при цьому відбуваються грубі зміни клітинних структур, а іноді і зовнішнього вигляду клітин, наприклад їх зморщування. Для дослідження тонкої будови клітини вдаються до фіксації різними хімічними речовинами (див. Додаток). Фіксуючу рідину наливають намазок, або препарат на певний час занурюють в стакан з фіксатором.
Забарвлення. Клітини мікроорганізмів фарбують головним чином аніліновими барвниками. Розрізняють кислі і основні барвники. До кислим барвників відносяться ті, у яких іон, що надає забарвлення (хромофор), - аніон. У основних барвників хромофором є катіон. Прикладом кислих барвників служить еозин, еритрозин, нігрозин, кислий фуксин; всі ці барвники інтенсивно зв'язуються з цитоплазм етичними компонентами клітини. Основні барвники - метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий, сафранін - інтенсивніше зв'язуються з ядерними компонентами клітини. Висока концентрація ДНК і рибосомальної РНК в клітині бактерій робить її більш чутливою до основних фарбників. У зв'язку з цим в мікробіологічній практиці застосовуються майже виключно основні барвники.
Розрізняють прості і диференціальні способи фарбування мікроорганізмів. При простій забарвленні фарбується вся клітина, так що стають добре видно її форма і розміри. Диференціальна забарвлення передбачає фарбування не всієї клітини, а певних її структур. За допомогою диференціальної забарвлення виявляють деякі клітинні структури і запасні речовини.
Для простого фарбування клітин мікроорганізмів найчастіше користуються фуксином, генціановий фіолетовим, метиленовим синім. Фіксований препарат поміщають на паралельні скляні рейки, що лежать над кюветой, і заливають барвником на 1-3 хв. Стежать за тим, щоб під час фарбування розчин барвника на мазку НЕ підсихали. У разі необхідності на мазок наливають нові порції барвника.
Після закінчення забарвлення препарат промивають водою до тих пір, поки що стікає вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують на повітрі або обережно промокають фільтрувальної папером, поміщають на пофарбований мазок краплю иммерсионного масла і переглядають з об'єктивом 90Х- Для отримання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальної папером. Метод фарбування в модифікації Синьова дозволяє використовувати замість розчинів барвників фільтрувальну папір, заздалегідь просочену барвником.
В правильно пофарбованому і добре промиті препараті поле зору світле і чисте, пофарбовані тільки клітини мікроорганізмів. Фіксувати і фарбувати можна також і препарати «відбитки». Фіксовані, пофарбовані препарати можуть зберігатися тривалий час.
Форму клітин і їх поєднання (ланцюжки, розетки, пакети, тетради і т. Д.) Виявляють, як правило, на препаратах «роздавлена крапля» в светлопольном або фазово-контрастному мікроскопі. Для визначення форми клітин дрібних паличковидних бактерій таких, як Serratia marcescens, готують препарат фіксованих клітин і фарбують їх простим способом. Клітини дрібних бактерій, що мають вирости (пологи Stella, Caulobacter, Prosthecomi-crobium), доцільно досліджувати в темному полі. Природне розташування клітин в колонії мікроорганізмів, а також спор і спороносцев у актиноміцетів і міцеліальних грибів вивчають на препараті «відбиток».
Необхідно пам'ятати, що вік культури, склад середовища та умови культивування суттєво впливають на морфологію і цитологію мікроорганізмів.
6.2.3. Визначення розмірів клітин мікроорганізмів
Клітини мікроорганізмів вимірюють під мікроскопом за допомогою окулярної лінійки - мікрометра або окулярного гвинтового мікрометра. Для вимірювання краще використовувати живі, а не фіксовані клітини, так як фіксація і забарвлення клітин призводять до деякої зміни їх справжніх розмірів. Зручно визначати розміри клітини, користуючись фазово-контрастним пристроєм. Якщо клітини рухливі, препарат злегка підігрівають або до краплі досліджуваної суспензії додають краплю 0,1% -ного водного розчину агару. Розміри клітин висловлюють в мікрометрів (мкм).
Окулярний мікрометр являє собою круглу скляну пластинку, в центрі якої викарбувано лінійка довжиною 5 мм. Лінійка розділена на 50 частин. Окулярний мікрометр вставляють в окуляр. Для цього вигвинчують очну лінзу окуляра, поміщають на його діафрагму окулярний мікрометр поділами вниз і загвинчують лінзу. Однак поділами окуляр-мнкрометра не можна безпосередньо виміряти величину клітини, так як останні розглядаються через об'єктив і окуляр, а ділення лінійки - тільки через верхню лінзу окуляра. Тому, перш ніж приступити до вимірювання величини клітин, необхідно визначити ціну поділки окулярного мікрометра для даного збільшення мікроскопа, що роблять за допомогою об'єктивного мікрометра.
Об'єктивний мікрометр (рис. 53) - це металева пластинка з отвором в центрі. В отвір вставлено скло, на яке нанесена лінійка довжиною 1 мм. Вона розділена на 100 частин, т. Е. Поділ об'єктивного мікрометра відповідає 0,01 мм, або 10 мкм. Для визначення ціни поділок окулярного мікрометра об'єктивний мікрометр поміщають на столик мікроскопа і фокусують при малому збільшенні. Зображення лінійки переміщують в центр поля зору і тільки після цього
змінюють об'єктив на той, при якому будуть визначатися розміри клітин. Переміщаючи столик мікроскопа і повертаючи окуляр, встановлюють мікрометри так, щоб їх шкали були паралельні і одна перекривала іншу. Ціну поділу окулярного мікрометра визначають за принципом ноніуса, т. Е. Поєднують одне з поділок шкали окулярного і об'єктивного мікрометрів і знаходять наступне їх поєднання (рис. 54). Встановлюють, скільком контрольними позначками об'єктивного мікрометра відповідає 1 розподіл окуляр
Рис 54 Визначення Ціни поділу об'єктивного
мікрометра- / - поділ об'єктивного мікрометра; 2 - розподіл окулярного мікрометра
ного мікрометра. Наприклад, 2 ділення об'єкт-мікрометра (20 мкм) відповідають 5 поділів окуляр-мікрометра, отже, 1 розподіл окуляр-мікрометра дорівнює 4 мкм (20: 5). Якщо тепер на столик мікроскопа покласти препарат з клітинами мікроорганізмів і розглядати його при тому ж збільшенні, то можна виміряти величину клітини. Для цього визначають, якого числа поділів окулярної лінійки відповідає величина вимірюваного об'єкта, і множать це число на ціну поділки окулярного мікрометра.
Зручно визначати розміри клітин за допомогою гвинтового окулярного мікрометра MOB-1-15. Гвинтовий окулярний мікрометр закріплюють на тубусі мікроскопа, попередньо вийнявши окуляр. В окулярі гвинтового мікрометра є нерухома шкала з ціною поділки 1 мм для визначення розмірів великих об'єктів і рухома пластинка з перехрестям. Платівка пов'язана з мікр