Перспективи розвитку клітинної трансплантології
Розвиток сучасної клітинної трансплантології і її впровадження в клініку в останні десятиліття дозволило продовжити життя багатьом тисячам пацієнтів. В даний час наука про трансплантацію клітин залишається однією з найбільш інтенсивно розвиваються областей біології і медицини. Уже проходять клінічні випробування такі методи, як:
- трансплантація власних гемопоетичних клітин при розсіяному склерозі, системний червоний вовчак, ревматоїдному артриті;
- трансплантація гемопоетичних клітин при лікуванні злоякісних пухлин нирок, молочної та підшлункової залоз, головного мозку;
- трансплантація донорських стовбурових клітин для профілактики реакції «трансплантат проти господаря» після попередньої трансплантації гемопоетичних клітин;
- адаптивна імунотерапія (цитотоксичні Т-лімфоцити) в онкології, клітинні онковакціни;
- трансплантація міобластів скелетної м'язової тканини;
- трансплантація нейрональних клітин пацієнтам з постинсультной синдромом;
- трансплантація власних і донорських клітин кісткового мозку для поліпшення регенерації кісткової тканини після переломів.
Успіхи в області вивчення стовбурових клітин багато в чому обумовлені підвищеним інтересом вчених і клініцистів до перспектив їх використання в лікуванні захворювань, в даний час вважаються невиліковними. Однак при цьому виникає багато етичних питань (таких, наприклад, як використання в якості трансплантаційного матеріалу клітин ембріонів людини), а також питань, пов'язаних з правовим регулюванням клітинних технологій. У розвитку клітинних технологій найбільш перспективними вважаються такі напрямки:
- виділення і трансплантація стовбурових клітин, в тому числі власних клітин пацієнта;
- виявлення субпопуляцій і клонів стовбурових клітин;
- тестування безпеки трансплантації (інфекційної, онкогенної, мутагенної), складання «клітинного паспорта»;
- виділення індивідуальних ліній ембріональних стовбурових клітин методом перенесення ядра соматичної клітини;
- корекція генетичних дефектів пренатальної трансплантацією клітин або комбінацією методів перенесення ядра і генетичної терапії.
тканинна інженерія
Одним з напрямків біотехнології, яке займається створенням біологічних заступників тканин і органів, є тканинна інженерія (ТІ).
Сучасна тканинна інженерія почала оформлюватися в самостійну дисципліну після робіт Д.Р. Уолтера і Ф.Р. Мейєра (1984), яким вдалося відновити пошкоджену рогівку ока за допомогою пластичного матеріалу, штучно вирощеного з клітин, взятих у пацієнта. Цей метод отримав назву кератінопластіка. Після симпозіуму, організованого Національним науковим фондом США (NSF) в 1987 р тканинна інженерія стала вважатися новим науковим напрямком в медицині. До теперішнього часу більшість робіт в цій області виконано на лабораторних тваринах, але частина технологій вже використовується в медицині.
Створення штучних органів складається з декількох етапів (рис. 2).
Мал. 2. Схема процесингу тканеінженерной конструкцій
На першому етапі відбирають власний або донорський клітинний матеріал (біопсія), виділяють тканеспеціфічние клітини і культивують їх. До складу тканеінженерной конструкції, або графтов, крім культури клітин входить спеціальний носій (матриця). Матриці можуть бути виконані з різних біосумісних матеріалів. Клітини отриманої культури наносяться на матрицю, після чого така тривимірна структура переноситься в біореактор1 з живильним середовищем, де інкубується протягом певного часу. Перші біореактори були створені для отримання штучної печінкової тканини.
Для кожного типу вирощуваного графтов підбирають спеціальні умови культивування. Наприклад, для створення штучних артерій використовують проточний біореактор, в якому підтримується постійний протока живильного середовища з перемінним пульсовим тиском, що імітує пульсацію струму крові.
Іноді при створенні графтов використовують технологію префабрікаціі: конструкцію спочатку поміщають нема на постійне місце, а в область, добре снабжаемую кров'ю, для дозрівання і формування мікроциркуляції всередині графтов.
Як клітинного матеріалу для створення штучних органів застосовують культури клітин, що входять до складу регенерируемой тканини або є їх попередниками. Так, наприклад, при отриманні графтов для реконструкції фаланги пальця були використані прийоми, що викликають спрямовану диференціювання стовбурових клітин кісткового мозку в клітини кісткової тканини.
Якщо для створення графтов застосовувався власний клітинний матеріалу пацієнта, то відбувається практично повна інтеграція графтов із якнайшвидшим відновленням функції регенерованого органу. У разі використання графтов з донорськими клітинами в організмі включаються механізми індукції і стимуляції власної репаративної активності, і за 1-3 місяці власні клітини повністю заміщають руйнуються клітини графтов.
Біоматеріали, які використовуються для отримання матриць, повинні бути біологічно інертними і після графтінга (перенесення в організм) забезпечувати локалізацію нанесеного на них клітинного матеріалу в певному місці. Більшість біоматеріалів тканинної інженерії легко руйнуються (резорбируются) в організмі і заміщаються його власними тканинами. При цьому не повинні утворюватися проміжні продукти, що володіють токсичністю, що змінюють рН тканини або погіршують ріст і диференціювання клітинної культури. Нерезорбіруемие матеріали майже не застосовуються, тому що вони обмежують активність регенерації, викликають надмірне утворення сполучної тканини, провокують реакцію на сторонній предмет (инкапсуляцию).
Для створення тканин і органів застосовуються в основному синтетичні матеріали, матеріали на основі природних полімерів (хітозан, альгінат, колаген), а також біокомпозітние матеріали (табл. 3).
Таблиця 3. Класи біоматеріалів, які застосовуються в тканинної інженерії.
Ремоделювання з заміною власними білками
Шовний матеріал, в ТІ (тривимірні моделі, плівки) як матриця-носій для практично всіх культур клітин
Одними з перших в тканинної інженерії стали застосовуватися біодеградіруемие синтетичні біоматеріали на основі полімерів органічних кислот, наприклад молочної (PLA, полілактат) і гліколевої (PGA, полігліколід). При цьому до складу полімеру може входити як один тип кислотного залишку, так і їх поєднання в різних пропорціях. Матриці на основі органічних кислот лягли в основу створення таких органів і тканин, як шкіра, кістка, хрящ, сухожилля, м'язи (поперечно-смугаста, гладенька і серцева), тонка кишка і ін. Однак у цих матеріалів є недоліки: зміна рН навколишніх тканин при розщепленні в організмі і недостатня механічна міцність, що не дозволяє використовувати їх як універсальний матеріал для матриць і підкладок.
Особливе місце серед матеріалів для Біоматриця-носіїв займають колаген, хітозан і альгінат.
Колаген практично не має антигенних властивостей. Використаний в якості матриці, він руйнується за рахунок ферментативного гідролізу і структурно заміщається власними білками, які синтезуються фибробластами. З колагену можуть бути виготовлені матриці із заданими властивостями для реконструкції практично будь-яких органів і тканин. Будучи природним тканинним (міжклітинних) білком, він оптимально підходить в якості носія культури клітин, забезпечуючи зростання і розвиток тканини.
Альгінат - полісахарид з морських водоростей, може бути використаний в якості матриці-носія, проте не володіє достатньою біологічною сумісністю і оптимальними механічними властивостями. Зазвичай він використовується у вигляді гідрогелю для відновлення хрящової і нервової тканини.
Хтозна - азотвмісний полісахарид, який є основною складовою зовнішнього покриву комах, ракоподібних і павукоподібних. Цей біоматеріал отримують з хітинових панцирів ракоподібних і молюсків. В даний час заслуговує на увагу комбінований по складу препарат - колагенової-хітозановий комплекс. В ході лабораторних і клінічних досліджень була показана його інертність і здатність зберігати життєздатність клітинної культури як in vitro. так і in vivo. Цей комплекс дозволений Міністерством охорони здоров'я РФ в якості перев'язувального, ранозагоювальний засіб і вже використовується в клінічній практиці в хірургії та стоматології.
Сучасні можливості тканинної інженерії
Більшість досліджень в області тканинної інженерії спрямовані на отримання того чи іншого еквівалента тканин. Саме вивчене напрямок тканинної інженерії - реконструкція сполучної тканини, особливо кісткової. У першій роботі в цій галузі була описана реконструкція кістково-хрящового фрагмента стегнової кістки кролика. Основною проблемою, з якою зіткнулися дослідники, був вибір біоматеріалу та взаємодія кісткової і хрящової тканин в графтов. Еквіваленти кісткової тканини отримують шляхом спрямованої диференціювання стовбурових клітин кісткового мозку, пуповинної крові або жирової тканини. Потім отримані остеобласти наносять на різні матеріали, що підтримують їх розподіл, - донорську кістка, PGA, колагенові матриці, пористий гідроксиапатит і ін. Графт відразу поміщають в місце дефекту або попередньо витримують у м'яких тканинах. Основною проблемою таких конструкцій дослідники вважають невідповідність швидкості освіти кровоносних судин в новій тканини і термінів життя клітин в глибині графтов. Для вирішення цієї проблеми графт розміщують близько великих судин.
Гістогенез м'язових тканин в великій мірі залежить від розвитку нервово-м'язових взаємодій. Відсутність адекватної іннервації конструкцій м'язових тканин поки не дозволяє створити функціонуючі тканинні еквіваленти поперечно-смугастої м'язової тканини. Гладка мускулатура менш чутлива до денервації, тому що має деяку здатність до автоматизму. Гладком'язові тканинні конструкції використовують при створенні таких органів, як сечовід, сечовий міхур, кишкова трубка. Останнім часом все більша увага приділяється спробам реконструкції серцевого м'яза за допомогою графтов, що містять серцеві міоцити, отримані шляхом спрямованої диференціювання малодиференційовані клітин кісткового мозку.
Одним з найважливіших напрямків в тканинної інженерії є виготовлення еквівалентів шкіри. Живі еквіваленти шкіри, що містять донорські або власні шкірні клітини, в даний час широко застосовуються в США, Росії, Італії. Ці конструкції дозволяють поліпшити загоєння великих опікових поверхонь.
Основними точками програми тканинної інженерії в кардіології можна вважати створення штучних клапанів серця, реконструкцію великих судин і капілярних мереж. Імплантати з синтетичних матеріалів недовговічні і часто призводять до утворення тромбів. При використанні трубчастих (судинних) графтов на біодеградіруемих матрицях отримані позитивні результати в експериментах на тваринах, однак невирішеною проблемою залишається контрольована міцність і сила опору стінок графтов пульсовому тиску крові.
Створення штучних капілярних мереж актуально при лікуванні патологій мікроциркуляції крові при таких захворюваннях, як облітеруючий ендартеріїт, цукровий діабет та ін. Позитивні результати тут отримані при використанні біодеградіруемих графтов, виконаних у вигляді судинної мережі.
Відновлення органів дихання, таких як гортань, трахея і бронхи, також можливо за допомогою тканинних конструкцій з біодеградіруемих або композитних матеріалів з нанесеними на них епітеліальними клітинами і хондробласти.
Захворювання і вади розвитку тонкого кишечника, що супроводжуються його значним укороченням, призводять до того, що пацієнти змушені довічно отримувати спеціальні поживні суміші і парентеральні розчини. У таких випадках подовження функціональної частини тонкого кишечника - єдина можливість полегшити їх стан. Алгоритм виготовлення графтов зводиться до наступного: на біодеградіруемие мембрану наносяться клітини епітеліального і мезенхімального походження і поміщаються в сальник або брижі кишки для дозрівання. Через певний час власну кишку з'єднують з графтов. Експерименти на тваринах показали поліпшення всмоктуючої активності, однак через відсутність іннервації штучна кишка не має здатності до перистальтики і регуляції секреторної активності.
Основна складність в тканинної інженерії печінки полягає в формуванні тривимірної структури тканини. Оптимальною Біоматриця для клітинної культури є позаклітинний матрикс печінки. Дослідники вважають, що до успіху призведе застосування пористих біополімерів із заданими властивостями. Робляться спроби застосування постійного магнітного поля для тривимірної організації клітинної культури. Залишаються невирішеними проблеми кровопостачання великих за розмірами графтов і відведення жовчі, оскільки в графтов відсутні жовчні протоки. Однак існуючі методики вже дозволяють компенсувати деяких генетичні аномалії печінкових ферментних систем, а також послабити прояви гемофілії у лабораторних тварин.
Конструювання залоз внутрішньої секреції знаходиться на стадії експериментальної перевірки методик на лабораторних тваринах. Найбільші успіхи досягнуті в тканинної інженерії слинних залоз, отримані конструкції, що містять клітини підшлункової залози.
Пороки розвитку сечовидільної системи складають до 25% всіх вад розвитку. Тканинна інженерія в цьому напрямку медицини дуже затребувана. Створення еквівалентів ниркової тканини - досить складне завдання, і вирішити цю проблему намагаються за допомогою технологій прямого органогенезу, використовуючи ембріональні закладки ниркової тканини. На лабораторних тваринах була показана можливість відновлення різних органів і тканин сечовидільної системи.
Однією з найважливіших завдань є відновлення органів і тканин нервової системи. Тканеінженерной конструкції можуть бути використані для відновлення як центральної, так і периферичної нервової системи. Як клітинного матеріалу для репарації спинного мозку можуть бути використані клітини нюхових цибулин і тривимірні біодеградіруемие гелі. Для периферичної нервової системи використовують біодеградіруемие трубчасті графти, всередині яких зростання аксона здійснюється по шваннівською клітини.
Створення штучних органів дозволить відмовитися від трансплантації здебільшого донорських органів, поліпшить якість життя і виживання пацієнтів. Найближчим часом ці технології будуть впроваджуватися в усі галузі медицини.