При більшості вірусних інфекцій розвиваються імунні реакції, що застосовуються для діагностики. Клітинні реакції зазвичай оцінюють в тестах цитотоксичності лімфоцитів відносно інфекційних агентів або заражених ними клітин-мішеней або визначають здатність лімфоцитів відповідати на різні АГ і мітогени.
У роботі практичних лабораторій вираженість клітинних реакцій визначають рідко. Більшого поширення знайшли методи ідентифікації противірусних AT.
РН заснована на придушенні цитопатогенного ефекту після змішування вірусу зі специфічними AT. Невідомий вірус змішують з відомими комерційними антисироватки і після відповідної інкубації вносять в моношар клітин. Відсутність загибелі клітин вказує на невідповідність інфекційного агента і відомих AT.
Гальмування гемаглютинації РТГА застосовують для ідентифікації вірусів, здатних агглютинировать різні еритроцити. Для цього змішують культуральну середу, що містить збудник, з відомою комерційної антисироватки і вносять в культуру клітин. Після інкубації визначають здатність культури до гемаглютинації і при її відсутності роблять висновок про невідповідність вірусу антисироватки. Гальмування цитопатичної ефекту інтерференцією вірусів Реакцію гальмування цитопатичної ефекту за рахунок інтерференції вірусів застосовують для ідентифікації збудника, интерферирующего з відомим Цитопатогенні вірусом в культурі чутливих клітин. Для цього в культуральне середовище, що містить досліджуваний вірус, вносять комерційну сироватку (наприклад, до вірусу краснухи при підозрі на неї), інкубують і заражають другу культуру; через 1-2 дня в неї вносять відомий Цитопатогенні вірус (наприклад, будь-який ЕСНО-вірус). При наявності цитопатогенного ефекту роблять висновок про те, що перша культура була заражена вірусом, що відповідав застосува # 1104; нним AT.
Серед інших тестів найбільшого поширення знайшла реакція прямої імунофлюоресценції (найбільш швидка, чутлива і відтворена). Наприклад, ідентифікація ЦМВ по цитопатогенного ефекту вимагає не менше 2-3 тижні, а при використанні мічених моноклональних AT ідентифікація можлива вже через 24 год. Маючи набір подібних реагентів, їх можна вносити в культури, заражені вірусом, інкубувати, відмивати незв'язаних реагент і дослідити з допомогою люмінесцентної мікроскопії (дозволяє виявити наявність флюоресценції заражених клітин).
Іммуноелектронная мікроскопія (аналог попереднього методу) дозволяє ідентифікувати різні види вірусів, виявлені електронною мікроскопією (наприклад, різні види герпесвірусів), що неможливо зробити, грунтуючись на морфологічних особливостях. Замість антисироваток для ідентифікації використовують помічені різними способами AT, але складність і дорожнеча методу обмежують його застосування.
Виявлення противірусних антитіл (AT) в сироватці крові. РГГА. РСК. РИФ.
Іммуносорбціонние методи виявлення противірусних антитіл.
Більш простий і доступний підхід - виявлення противірусних антитіл (AT) в сироватці. Зразки крові необхідно відбирати двічі: негайно після появи клінічних ознак і через 2
3 тижні. Надзвичайно важливо досліджувати саме два зразка сироватки. Результати одноразового дослідження не можна вважати остаточними через неможливість пов'язати появу AT з цим випадком. Цілком можливо, що ці AT циркулюють після попередньої інфекції. У подібній ситуації роль дослідження сироватки, отриманої в період реконвалесценції, важко переоцінити. На наявність захворювання в період відбору першої проби вказує не менше ніж чотирикратне збільшення титру AT, виявлене при дослідженні другої проби.
Перераховані нижче методи не дозволяють диференціювати антитіла (AT), що утворюються під час хвороби і циркулюючі після одужання (тривалість цього періоду варіабельна для різних інфекцій). Оскільки для адекватної діагностики необхідно підтвердити достовірне збільшення титрів AT в двох пробах, то першу пробу досліджують в гострій фазі, а другу - в період одужання (через 2-3 тижні). Отримані результати носять ретроспективний характер і більш придатні для проведення епідеміологічних обстежень. РГГА виявляє AT, синтезовані проти гемаглютиніну вірусів (наприклад, вірусу грипу).
Метод дозволяє легко виявляти подібні антитіла (AT) в сироватці хворого. РСК - основний метод серодиагностики вірусних інфекцій (серед доступних). Реакція виявляє комплементсвязивающіе IgM і IgG, але не диференціює їх; для оптимізації отриманих результатів постановка реакції вимагає певних навичок персоналу.
РИФ. При можливості отримати біоптат інфікованої тканини і доступності комерційних наборів AT, мічених флюоресцеином, діагноз може підтвердити реакція прямої імунофлюоресценції.
Постановка реакції включає інкубацію досліджуваної тканини з AT, їх подальше видалення і люмінесцентну мікроскопію зразка. Іммуносорбціонние методи виявлення противірусних антитіл Іммуносорбціонние методи (наприклад, ІФА і РІА) більш інформативні, оскільки виявляють IgM і IgG окремо, що дозволяє робити певні висновки про динаміку інфекційного процесу або стані реконвалесценції. Для виявлення AT відомий АГ сорбують на твердому субстраті (наприклад, на стінках пробірок, пластикових мікропланшетах, чашках Петрі) і вносять різні розведення сироватки пацієнта. Після відповідної інкубації Незв'язана AT видаляють, вносять антисироватки до Ig людини, мічену ферментом, повторюють процедуру інкубування та відмивання незв'язаних AT і вносять будь-якої хромогенний субстрат (чутливий до дії ферменту). Оскільки зміна забарвлення пропорційно вмісту специфічних AT, то цілком можливо визначення їх титру спектрофотометричним способом. В діагностиці ВІЛ-інфекції найбільшого поширення знайшов метод иммуноблотинга.
Виявлення вірусних антигенів (АГ). ІФА. В даний час вже з'явилися комерційні набори для виявлення АГ деяких збудників, що дозволяють їх ідентифікувати протягом 5-10 хв. Для виявлення АГ на твердій фазі сорбують відомі AT і додають сироватку, що містить АГ; після інкубування незв'язаний АГ декантирують, систему промивають і вносять мічені AT, специфічні до сорбованих AT. Повторюють процедуру інкубування та відмивання, вносять хромогенний субстрат, позитивний результат фіксують при зміні забарвлення системи. Гібридизація ДНК - високоспецифічний метод, що дозволяє ідентифікувати геном вірусу після його гібридизації комплементарними молекулами ДНК. Як маркера застосовують ферменти і ізотопи.
Метод визначає здатність вірусної ДНК гібридизувати з міченої комплементарної ДНК; специфічність методу прямо пропорційна довжині комплементарної ланцюжка. Перспективний метод гібридизації нуклеїнових кислот in situ. Для постановки реакції мічену ДНК наносять на біоптати тканин (в тому числі на фіксовані формаліном або ув'язнені в парафінові блоки) і реєструють взаємодія з комплементарної ДНК. Метод використовують для виявлення вірусів простого герпесу, папіломи людини, Епштейна-Барр та ін.