Після того, як ДНК зшита в пробірці, її необхідно розмножити, тобто клонувати. Мета: отримати численні копії бажаних генів. Для клонування невеликих фрагментів ДНК використовують плазміди або фагів ДНК, для великих - косміди і штучні хромосоми.
Існує два підходи до клонування ДНК:
1) використання бактеріальних або дріжджових клітин для розмноження введеної в них чужорідної ДНК.
2) ампліфікація ДНК in vitro.
Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномної і клонову (бібліотека кДНК).
Геномна бібліотека (банк генів, клонотекі) - це колекція клонів ДНК, що включає всі фрагменти, що входять в геном даного виду. Т. е. Банк генів ще можна назвати набором клонованих фрагментів геному. Якщо геном будь-якого організму розрізати, вставити в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітину, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмидной або фагової ДНК ймовірність випадання цілих і незмінених шматків генома досить висока.
Такий спосіб отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», так як геном в даному випадку представлений окремими фрагментами.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. З вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, так як вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більші шматки генома.
Для створення банку генів необхідно:
1) виділення всієї геномної ДНК
2) фрагментація ДНК рестріктазамі або ультразвуком
3) Очищені кільцеві молекули ДНК (вектори) обробляють тієї ж рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК додають до плазмидной в присутності лигаз. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК
4) рекДНК вводять в бактеріальні або дріжджові клітини, де плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій.
5) Клонування бактерій: кожна виникла колонія клітин представляє собою клон або потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід утворює бібліотеку геномної ДНК.
Недолік. фрагменти ДНК утворюються у величезній кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому лише частина фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити тільки частина гена або ж Інтрони послідовності.
Гідність: бібліотека генів може зберігатися і використовуватися необмежено довго.
-джерело матеріалу для вивчення структури, функції і регуляції індивідуальних генів, структури і функції білків
-збереження генофонду зникаючих видів
Аналогічні колекції, отримані з індивідуальних хромосом або їх частин, називаються хромосомними бібліотеками.