Люмінесцентний мікроскоп Olympus BX61 з цифровим фотоапаратом
Флуоресцентний мікроскоп (лат. Fluo - текти, грец. Μικρός - маленький і грец. Σκοπέω - дивлюся) - спеціалізований оптичний мікроскоп. призначений для вивчення властивостей органічних або неорганічних речовин з використанням явища флуоресценції (люмінесценції). дозволяє візуалізувати невидимі в звичайному світлі мікрооб'єкти, за рахунок їх люмінесценції. Принцип дії заснований на опроміненні зразка ультрафіолетовим світлом; додаткові можливості для дослідження біологічних структур дає використання спеціальних барвників для мікроскопії. здатних вибірково адсорбуватися на тих чи інших органелах біологічного препарату.
введення Правити
Процес поглинання енергії фотонів органічними і неорганічними речовинами, з подальшим випусканням променів, що мають іншу довжину хвилі, відомий як фізичне явище флюоресценції (світіння). електронна емісія світла в даному процесі флюоресценції за часом є одночасної з початком поглинання-збудження. При цьому випущені промені мають велику довжину хвилі ніж поглинені (випущені фотони мають меншу енергію ніж поглинені). У разі, коли час між поглинанням і випусканням становить більш мікросекунди, процес називається фосфоресценції.
Вперше це явище було відкрито англійцем Джорджем топить в 1852 році. Він зауважив, що мінеральний флюорит починав світитися червоним світлом, після висвітлення його ультрафіолетовими променями світла. Дослідження, проведені в ХIX столітті визначили, що багато речовин: кристали, смоли, сирі наркотики, масло, хлорофіл, вітаміни, неорганічні речовини, корисні копалини та ін. Флюоресцируют при освітленні їх променями ультрафіолетового світла. Лише з 1930 років началос використання явища флюоресценції, яке стали застосовувати в біологічних дослідженнях. Досліджувані елементи матеріалів, бактерії, хвороботворні мікоорганізми для виявлення їх в природному середовищі стали фарбувати флюорокрасітелямі. Деякі барвники використовувалися в мікроскопії і були згодом головним двигуном у створенні методу флюоресцентної мікроскопії з дозволом на нанометричну рівні (1-10нм), звідки пішло Флюоресцентная наноскопія.
Застосування світиться безлічі флюоромолекул, атомів дало можливість розпізнати мікрочастинки і окремі клітинні елементи аж до одного елемента - молекули. Незважаючи на те, що даний метод не здатний передати просторове зображення всього елемента нижче його межі дифракції, проте метод флюоресцентної наноскопіі здатний видати на екран або розглядати в оптичних окулярах мікроскопа зображення окремих молекул в 3D вимірі, розташованих в зоні і нижче дифракційної межі. Застосування забарвлення флюорокрасітелямі молекул, порушувані разом з самими молуламі, наприклад, ультрафіолетовими променями світла, викликає ефект збудження молекули, яка випускають трансформування кванти енергії випромінювання, достатні для отримання зображень мікроелементів певної і потрібної яскравості. Заздалегідь можна планувати виділення потрібних молекул за рахунок забарвлення їх флюорокрасітелямі, які виділяють їх при мікроскопії.
Основи збудження і емісії Правити
Мембрана осередку дріжджів, що візуалізується деякими мембранними білками (завдяки адсорбції флюоресцентних маркерів en: RFP і en: GFP. Жовтий колір зображення сформований при оптичної сумації спільного випромінювання обох маркерів)
Ці мікроскопи стали важливим інструментом в області біології, відкриваючи можливості для більш передових напрямків мікроскопії, типу конфокальної мікроскопії дозволяє отримувати зображення не тільки з поверхні, але і з деякої глибини зразка.
Основне завдання флоремікрокопа полягає в тому, щоб висвітлити досліджуваний об'єкт з належним і певним діапазоном довжин хвиль, після чого відокремити більш слабку що випускається флюоресценцію (спектр видимих променів) від світла збудження. У нормально сформованому флюоремікроскопе, саме емісійні промені забарвлених молекул повинні потрапляти в поле зору очей або фотодатчика. Важливо, щоб порушені флуоресцентні фарби при світінні додали світність забарвлених частинок, щоб вони відрізнялися високою яскравістю, контрастністю на темному (або чорному) тлі. Сяючі мікроелементи за рахунок відфільтрованих променів видимого спектру світла стають видимими за допомогою створення низької яскравості (темряви) фону. Світло збудження - як правило в кілька сотень тисяч до мільйона разів яскравіший, ніж світло, що випускається флюоресценцией (спектр видимих променів).
Принцип роботи сучасного флюоромікроскопа Правити
Схема роботи фільтрів флуоресцентного мікроскопа
Сучасний флюоремікроскоп розрахований на застосуванні дослідження епітаксійного шару методом передачі зображення, створеного і відбитого при флюоремікроскопіі. Основою конструкції даного мікроскопа є можливість застосування вертикального потоку променів в діапазоні довжин хвиль ультрафіолетових, синіх або зелених променів видимого спектру світла, який утворюється, передається багатоспектральних джерелами світла, наприклад, лампою дуги або іншим джерелом з довжиною хвилі, відфільтрований фільтром променів збудження. Даний потік променів, відбиваючись від фільтра - дихроическим дзеркала або светоделітель, проходить через досліджуваний зразок (мета), рясно його висвітлюючи. При відображенні і повернення променів світла емісії (збудження) він проходить через двокольорові дзеркало, фільтрується фільтром, який блокує небажані довжини хвиль збудження. В даному випадку флюоресценція - єдиний спосіб в оптичної мікроскопії, коли досліджуваний зразок слідом за збудженням починає світитися своїм власним світлом. Випромінюється їм світло повторно виходить сферически у всіх зазначених напрямках і не залежить вже від дії джерела променів світла збудження.
Мікроскопія окремих молекул Правити
В ідеальних умовах роботи флюоремікроскопа можливо побачити, зафіксувати поодинокі молекули. Пофарбовані, збуджені поодинокі молекули при емісії можливо при низьких величинах оптичного фону і шуму фотодатчика відфільтрувати слабкі видимі промені, які уловлюються фотодатчиком і фокусуються на темному тлі в фокальній площині, що дозволяє їх візуально розглядати. Єдина молекула здатна випустити 300000 фотонів до руйнування, фотовідбілювання, що досить для її фіксації.
Сучасний флуоресцентний мікроскоп працює в поєднанні ефективності оптичного методу мікроскопії з елементами комп'ютеризованого контролю систем мікроcкопа і систем соданія цифрового зображення АЦП. що дозволяє ширше використовувати візуальне спостереження зображень з оцифруванням, перетворенням їх у стереозображення в вигляді файлів з виходом на екрани монітора.
Удосконалення і досягнення оптичної мікроскопії в поєднанні з флюоресцентной привели до можливості управляти подклеточние структурами або частками благлдаря і в силу використання широкого діапазону спектроскопических величин.
Спосіб одержання й обробки зображень флуоресцентного мікроскопа доступний в габаритах традиційного лабораторного оптичного мікроскопа і містить:
Спосіб відрізняється тим, що в різних ділянках об'єкта періодично створюються видимі роздільно флуоресцирующие молекули і наночастинки. Лазер забезпечує таке їх збудження, яке досить не тільки для реєстрації їх неперекривающіхся зображень, але і для знебарвлення вже зареєстрованих флуоресціюючих молекул. При цьому десятки тисяч кадрів із зареєстрованими зображеннями одиночних молекул і наночастинок (у вигляді плям діаметром порядку довжини хвилі світла флюоресценіі, помноженої на збільшення мікроскопа), обробляються на комп'ютері для пошуку координат центрів плям і створення зображення об'єкта за мільйонами обчислених координат центрів плям, відповідних координатах індивідуальних флуоресціюючих молекул і наночастинок.
- Забезпечується можливість отримання двох-і тривимірного зображення 3D з дозволом 1-10 нм.
- Іметcя можливість реєстрації кольорового зображення при прокраске різними барвниками білків, нуклеїнових кислот, ліпідів. [2] [3]
Флюресцентний мікроскоп - інструмент з унікальними можливостями для гістологічного дослідження тканин людини, тварин і рослин. Він використовується для проведення иммунохимических, імунологічних, иммуноморфологических і імуногенетичних досліджень.
Взагалі, основний принцип роботи флуоресцентного мікроскопа полягає в опроміненні зразка заданої певної смугою довжин хвиль, що викликають флуоресценцію зразка. Далі необхідно виділити набагато більше слабке випромінювання флуоресценції. В ідеально налагодженому мікроскопі, тільки світло від флуоресценції повинен досягти очі дослідника або детектора так, щоб в результаті флуоресцентні структури виділялися з високою контрастністю на дуже темному (або чорному) тлі. Проблема полягає в тому, що світло збудження, як правило, в декілька сотень тисяч, а іноді і в мільйон разів яскравіше, ніж світло випромінюється флуоресценції в зв'язку з барвниками. Застосовувані фільтри, використовуючи короткочасність потужної флюоресценції барвників і більш меншу швидкість більш слабкою флюоресценції досліджуваного зразка живого білка (наприклад, зрізу сітківки ока курчати), отримують зображення, наприклад, колб і паличок в кольорі, обсязі на високому молекулярному рівні. На малюнку показана схема (в розрізі) сучасного флуоресцентного мікроскопа для проведення досліджень в прохідному і відбитому світлі.
пристрій Правити
Пристрій флуоресцентного мікроскопа Olympus BX 51 для дослідження зразків методом епі-флуоресценції в прохідному і відбитому світлі
Флюоресцентний мікроскоп містить один, або кілька джерел ультрафіолетового або синього світла. Поглинаючи це випромінювання, окремі структурні елементи зразка випускає видиме світло завдяки власній люмінесценції [4] або випромінювання від флюоресцентних барвників - маркерів, здатних адсорбуватися на тих чи інших тканинах (наприклад на мембранних білках, окремих хромосомах і т.д.).
застосування Правити
Флюоресцентний мікроскоп - інструмент з унікальними можливостями для гістологічного дослідження тканин людини, тварин і рослин. Він використовується для проведення иммунохимических, імунологічних, иммуноморфологических і імуногенетичних досліджень.
Завдяки своїм можливостям і технічним характеристикам, Флюоресцентні мікроскопи знайшли широке застосування у фармацевтичній промисловості, ветеринарії. рослинництві. в біотехнології. Флюоресцентні мікроскопи, що працюють за принципом прямого відображення, практично незамінні при проведенні криміналістичних експертиз і санітарно-епідеміологічних досліджень. [5]
Флюоресцентні мікроскопи, що випускаються до недавнього часу, володіли одним досить серйозним недоліком: вони були громіздкими і важкими. Використання при проведенні сучасних досліджень спеціальних флюоресцирующих і ферментних міток дозволило значно зменшити розміри флюоресцентних мікроскопів, зробити їх легкими і компактними. Поєднання класичного люмінесцентного мікроскопа з можливостями цифрових технологій дозволило наділити їх великими можливостями, фіксувати результати спостережень і зберігати їх в цифровому форматі.
Основними областями застосування флюоресцентних мікроскопів (в яких вони просто незамінні) є наступні:
- діагностика бактеріальних, вірусних та інших інфекцій антигенного складу
- аналіз клітин крові кісткового мозку
- гістологічні дослідження живих клітин сітківки ока. наприклад,
Рис.1 На знімку, отриманому на флюоресцентної мікроскопі всі дані колб і паличок в обсязі і кольорі. Жирові крапельки (нафтові крапельки) визначають класифікацію фоторецепторів колб курчати в кольорі. Палички безцветно, тому що вони не беруть участі в кольоровому зорі.
Дано типи фоторецепторів колб в кольорі в типових відносинах Кольорове зір у птахів
Галерея Правити
