Мета роботи: ознайомитися з методом визначення ізоелектричної точки (ВЕТ) білка.
Короткий теоретичне введення.
На поверхні частинок дисперсної фази при їх контакті з рідиною мимовільно виникає надлишковий електричний заряд і формується потенціалобразующій шар іонів. До твердої поверхні з рідкого середовища притягуються іони, знак яких протилежний знаку потенціалобразующего шару. Вони називаються противоионами. Виникає подвійний електричний шар (ДЕС). Його можна розглядати як своєрідний конденсатор, внутрішня обкладка якого формується з потенціалобразующего шару іонів, а зовнішня - з противоионов. Протівоіони знаходяться в двох положеннях: одна їх частина утворює адсорбційний шар, інша перебуває в дифузному шарі.
Потенціал, що виникає на поверхні колоїдної частинки, називається електрокінетичних або # 950; (Дзета) -потенціалом. Електрокінетичний потенціал чисельно дорівнює роботі, яку потрібно зробити при перенесенні одиниці заряду з поверхні гранули в глиб дисперсійного середовища або навпаки.
Точка, в якій електрокінетіческій потенціал дорівнює нулю, називається ізоелектричної точкою. У цій точці відбувається повна компенсація потенціалобразующего шару противоионами, тобто все потівоіони будуть знаходитися в адсорбционном шарі.
У даній лабораторній роботі потрібно визначити ізоелектричної точки білка.
Загальну формулу молекули білка можна записати в такий спосіб:
R- вуглеводневий радикал,
NH2 - аминогруппа, яка володіє основними властивостями, тому що в кислому середовищі приєднує протон з утворенням іона NH3 +,
HOOC-кислотна група, яка дисоціює на іон водню H + і кислотний залишок - COO -.
У кислому середовищі колоїдна частка білка має позитивний заряд:
а в лужному середовищі - негативний заряд:
Стан макромолекул білка, при якому число іонізованих кислотних груп дорівнює числу іонізованих основних груп і, отже, середній сумарний заряд макромолекул дорівнює нулю, називається ізоелектричної станом. Значення рН розчину, при якому молекули білка знаходяться в ізоелектричному стані, називається ізоелектричної точкою (ВЕТ). Ізоелектрична точка є найважливішою характеристикою білка, що визначає його властивості в тому чи іншому середовищі.
Ізоелектричної точки визначають для казеїну або желатину.
Ретельно розтирають білок (казеїн або желатин) в ступці до стану пудри. У мірну колбу на 100 мл поміщають 0,4 г білка, додають 10 мл 1 н розчину ацетату натрію і 70 мл води. Колбу підігрівають до 70 ° С і при енергійному струшуванні розчиняють білок. Потім додають до мітки воду. Розчин може бути злегка мутним, але не повинен містити пластівців і осаду.
У 7 склянок згідно їх номерами (див. Таблицю 6) доливають воду і оцтову кислоту. Потім в кожну склянку додають по 5 мл колоїдного розчину білка і через 10 хв відзначають, в яких розчинах сталася коагуляція.
Таблиця 6. Визначення ВЕТ білка.
У графі «Спостереження» записують: «немає коагуляції», «помутніння», «осад», «найбільший осад».
Вимірюють рН всіх розчинів за допомогою рН-метра.
В роботі використовується кишеньковий рН-метр PICCOLO-рН-метр виготовлення фірми HANNA. Цей рН-метр має масу 100 г і працює від батареї. Електродна система приладу об'єднує в собі рН-електрод, електрод порівняння, термодатчик і підсилювач. Така система дозволяє звести до мінімуму вплив вологості, забруднень і перешкод на точність рН-вимірювань. PICCOLO дає майже такі ж точні свідчення, як і стаціонарні рН-метри (± 0,02 рН). Автоматична термокомпенсация, завдяки вбудованому термодатчику і мікропроцесора PICCOLO, автоматично компенсує вплив температури в діапазоні від 0 до 70 ° С, що забезпечує високу точність вимірювань рН.
Після тривалого зберігання рН-метр вимочується в - розчині HI 70300L або буферному розчині з рН 7,01 протягом 4-х годин. Потім проводиться двоточкова калібрування приладу. Для цього:
1) електрод сполоснути деионизированной водою, потім буферним розчином HI7007;
2) занурити електрод (рис.7) в буферний розчин HI 7007;
3) включити прилад (вимикач "ON / OFF"
(1, рис.7) і за допомогою каліброваного гвинта "рН7" встановити показання приладу до рН7,01;
4) електрод сполоснути деионизированной водою, потім буферним розчином HI7004;
5) занурити електрод у буферний розчин HI7004 і підкрутити викруткою гвинт «рН 4», - поки індикатор покаже значення рН 4,01 (при 25 ° С). Вимкніть прилад за допомогою вимикача ON / OFF (1 на рис.7).
У звіті вкажіть, будь значенням рН відповідає ізоелектричної точка досліджуваного білка.
1. Поясніть механізм утворення подвійного електричного шару на поверхні дисперсної частинки.
2. Що називають Електрокінетичні потенціалом?
3. Назвіть електрокінетіческіе явища в дисперсних системах і поясніть, чим вони обумовлені.
4. Як можна визначити електрокінетіческій потенціал?
5. Що називають ізоелектричної точкою білка? Наведіть схематичну формулу макромолекули білка, що знаходиться в ізоелектричному стані.
Лабораторна робота №9.